昆仑雪菊中原花青素B2、绿原酸含量测定及对小鼠血糖的影响*

刘 萍，段雅彬 ，陈红凯，郝智红，陈湘宏

1青海大学附属医院，青海 西宁 810001；2青海大学医学院

据WHO统计，全球约有2.2亿糖尿病患者，其中2型糖尿病发病率高，在全球范围内呈逐年升高趋势［1］。目前治疗糖尿病的药物主要为α-葡萄糖苷酶抑制剂以及胰岛细胞增敏剂等。由于药物的副作用导致其使用受限，因此从天然产物中寻找高效、低毒的降血糖药物成为研究热点。

昆仑雪菊为菊科金鸡菊属，分布在昆仑山海拔3 000米左右的地区，昆仑雪菊维吾尔语为“古丽恰尔”，是维医常用的药材之一，有清热解毒、活血化瘀、清肝明目、润肠通便等功效［2-4］。现代医学［5-6］证明昆仑雪菊中含有大量的黄酮类物质以及人体必需的矿物元素，具有降血压、降血脂、抗肿瘤、清除自由基等作用。原花青素B2和绿原酸是昆仑雪菊的主要有效成分，国内外鲜有文献报道昆仑雪菊中原花青素B2和绿原酸的分离和含量鉴定。近年来国内学者主要对昆仑雪菊中的生物碱、总黄酮等物质进行了提取分离，但原花青素B2和绿原酸两种单体成分的分离和含量测定尚未见报道。本研究采用RP-HPLC法测定昆仑雪菊中原花青素B2和绿原酸的含量。采用链脲霉素和高脂饲料诱导高脂高糖小鼠模型，观察昆仑雪菊的降血糖作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 昆仑雪菊（购自青海省中藏药材市场，经青海大学医学院中药教研室鉴定）；原花青素B2标准品（美国 ChromaDex公司，批号：00016231-014，纯度：97.2%）；绿原酸标准品（中国药品生物制品检定所，批号：120753-2006879，纯度：98%）；链脲霉素（Streptozocin，STZ，美国Sigma公司）；二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）；高脂饲料（江苏美迪森生物医药有限公司）。1.2 主要试剂 超氧化物歧化酶试剂盒（SOD，批号：20150105）及丙二醛试剂盒（MDA，批号：20150107）均购自南京建成生物有限公司；石油醚为分析纯（济南泉鲁中康化工有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（山东禹王实业有限公司）。

1.3 主要仪器 Aglient 1200高效液相色谱仪（美国Aglient公司）；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；TGL-16 B型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；KA-1000型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-IIID型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；GA-3血糖仪（深圳市三诺电子有限公司）；RT-2100C酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；DRT-2N型电热套（郑州大城科工贸有限公司）；YDS-30东亚液氮容器（乐山市东亚机电工贸有限公司）；BT224S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；XW-80A漩涡混合器（上海医大仪器厂）；中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.4 动物 SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量25～28 g，购自兰州大学医学院，合格证号：SCXK（甘）2015-0001，分笼饲养。光照明暗12小时交替，自由饮水，温度：（23±2）℃，湿度：50%～60%。

1.5 方法

1.5.1 药物提取 取昆仑雪菊适量，中药粉碎机打粉，用水作为提取溶剂，液料比 1∶20（m/v），60℃提取1小时，连续3次，合并每次所得滤液，石油醚脱脂，正丁醇萃取，用旋转蒸发仪浓缩至干，冷冻干燥回收干粉，用水配制1 g/mL的溶液，4℃避光保存，待用。

1.5.2 原花青素B2和绿原酸的测定 取“1.5.1”项下溶液，加水溶液100 mL于棕色瓶中，0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.5.3 对照品溶液的配制 精密称定原花青素B2和绿原酸对照品1mg，加甲醇1mL，配制成1mg/mL的溶液。加甲醇分别配制成 1、2、5、10、25、50、80 μg/mL 的溶液。

1.5.4 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.01%磷酸；流速：1 mL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL；检测波长：315 nm；线性洗脱见表1。

表1 线性洗脱

1.5.5 线性关系考察 取 1、2、5、10、25、50、80μg/mL对照品溶液，分别进样，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，做直线回归。原花青素B2和绿原酸标准曲线方程分别为：

结果表明原花青素B2和绿原酸在1～80 μg/mL范围内线性关系良好。

1.5.6 精密度实验 取10 μg/mL对照品溶液，重复进样5次，原花青素B2和绿原酸RSD分别为0.87%，0.95%，表明精密度良好。

1.5.7 重复性实验 取同一批样品5份，精密称定，按“1.5.2”项下方法操作测得原花青素B2和绿原酸RSD分别为1.4%，0.95%，表明重复性良好。1.5.8 加样回收率实验 取同一批样品5份，精密称定，分别加入原花青素B2对照品46 μg，按“1.5.2”项下方法操作，计算回收率。得原花青素B2和绿原酸平均回收率分别为101.2%、99.8%。RSD 分别为 1.02%、1.12%。

1.5.9 动物分组 将60只小鼠随机分为对照组、阳性组（二甲双胍，200 mg/kg）、模型组及昆仑雪菊高（4 g/kg）、中（2 g/kg）、低（1 g/kg）剂量组，雌雄各半，每组10只。

1.5.10 给药方法 昆仑雪菊高、中、低剂量组和阳性组灌胃给予相应药物，对照组、模型组给予等容积生理盐水，剂量为 0.02 mL/（g·d），连续14 天。

1.5.11 糖尿病模型制作 对照组正常饲料喂养，其余各组小鼠予高脂饲料喂养4周，喂养第29天腹腔注射STZ柠檬酸缓冲液（100 mg/kg），对照组腹腔注射生理盐水，全程冰浴操作。60小时后各组小鼠禁食12小时，剪尾取血并测定小鼠空腹血糖值，选择血糖≥11.1 mmol/L的小鼠为成功模型。

1.5.12 指标检测 造模前后以及给药后7天和14天分别剪尾测定小鼠血糖值。末次给药后摘眼球取血，2 500 r/min，离心15分钟，制备血清，按照试剂盒方法测定小鼠SOD和MDA。1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，多个时间点指标比较采用重复测量数据的两因素多水平分析，若方差不齐采用秩和检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 原花青素B2和绿原酸样品含量测定 按上述色谱条件进样分析，测得其峰面积，并带入标准曲线方程计算原花青素B2和绿原酸的含量，结果见表2、图1。

图1 H PLC测定昆仑雪菊中原花青素B2和绿原酸的含量

2.2 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠体质量的影响 造模前小鼠体质量低于造模后（P＜0.05），阳性组给药后3、7和14天与模型组相比，体质量呈增加趋势。予昆仑雪菊提取物后小鼠体质量回升（P＜0.05），尤以给药后14天体质量恢复最为明显，见表3。

2.3 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠血糖的影响 造模后与对照组相比，各给药组和模型组血糖值升高（P＜0.05）。给药7天后，各给药组血糖值与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。给药14天后，昆仑雪菊提取物各剂量组血糖值降低（P＜0.05），尤以高剂量组明显。造模前后及用药后昆仑雪菊各剂量组与阳性组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表3 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠体质量的影响（±s）

表3 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠体质量的影响（±s）

组别 只数 剂量/（g·kg-1） 体质量/g造模前 造模后 用药后3天 用药后7天 用药后14天对照组 10 - 26.12±1.56 30.56±1.47 32.65±1.25 33.14±1.25 34.21±1.52模型组 10 - 26.25±1.88 31.25±1.99 29.65±1.28 26.55±1.48 25.98±1.21阳性组 10 0.2 27.15±1.98 31.89±2.01 28.56±1.72 28.76±1.69 30.15±1.94雪菊高剂量组 10 4 26.98±1.74 31.25±1.25 29.41±1.49 29.54±1.87 31.25±2.25雪菊中剂量组 10 2 26.14±1.32 30.65±1.36 29.72±1.24 30.12±1.97 31.56±1.36雪菊低剂量组 10 1 26.54±1.58 30.98±1.75 28.98±1.47 29.12±1.57 31.31±1.47

表4 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠血糖的影响（±s）

表4 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠血糖的影响（±s）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与造模后比较，P＜0.05

组别 只数 剂量/（g·kg-1） 血糖/（m m ol·L-1）造模前 造模后 用药后7天 用药后14天对照组 10 - 3.99±0.56 4.12±0.75 3.45±0.32 3.95±0.62模型组 10 - 4.12±0.91 21.85±5.62* 20.56±4.31* 21.29±3.18*阳性组 10 0.2 4.01±0.54 20.18±4.36* 19.62±3.35* 16.65±4.62*#△雪菊高剂量组 10 40 4.25±0.62 21.99±4.38* 18.64±3.96* 16.32±3.49*#△雪菊中剂量组 10 2 3.89±0.48 19.56±5.98* 19.62±4.25* 17.63±2.65*#△雪菊低剂量组 10 1 3.91±0.68 22.15±6.56* 20.65±3.59* 18.95±3.78*#△

2.4 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠SO D和M D A的影响 造模后小鼠 SOD 活力降低（P＜0.05），MDA 含量增加（P＜0.05），昆仑雪菊高、中、低剂量组SOD活力高于模型组（P＜0.05），MDA含量低于模型组（P＜0.05），阳性组与昆仑雪菊各剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠SO D和M D A的影响（±s）

表5 昆仑雪菊提取物对糖尿病小鼠SO D和M D A的影响（±s）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；△表示与阳性组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 剂量/（g·kg-1） SO D/（U·m g-1） M D A/（nm ol·m g-1）对照组 10 - 0.59±0.01 0.029±0.009模型组 10 - 0.23±0.01*△ 0.109±0.011*△阳性组 10 0.2 0.41±0.02*# 0.067±0.011*#雪菊高剂量组 10 4 0.39±0.02*# 0.061±0.009*#雪菊中剂量组 10 2 0.35±0.02*# 0.084±0.015*#雪菊低剂量组 10 1 0.31±0.01*# 0.081±0.013*#

3 讨论

本实验采用乙腈-磷酸作为流动相，尝试了多个洗脱条件，最终的洗脱条件所分离的原花青素B2和绿原酸的分离度良好，基线平稳。目前四氧嘧啶和链脲霉素是制作糖尿病模型广泛使用的药物，四氧嘧啶能通过产生大量自由基达到破坏胰岛β细胞的作用，自由基能够破坏DNA结构，激活多聚ADP核糖体合成酶的活性，从而使辅酶I含量下降，mRNA功能受损，胰岛素合成减少［7］。链脲霉素主要自行分解甲基正碳离子，与DNA呈链间交叉连结，使DNA烷化，并使受损的DNA难以修复，最终导致胰岛素缺乏［8］。有文献［9］证实四氧嘧啶对小鼠伤害较大，造模成功率低，容易因剂量导致动物死亡，并且本研究需要观察药物的抗氧化作用，而四氧嘧啶引起的自由基过剩会干扰实验结果，故本研究采用链脲霉素和高脂饲料诱导小鼠糖尿病模型。

体内大量自由基是导致糖尿病发生的重要因素［10］，SOD是生物体内抗氧化防御系统中的重要酶，能清除自由基，保护胰岛细胞［11-12］。MDA是体内过氧化损伤标志，可通过MDA间接了解过氧化损伤程度［13-15］。本研究结果显示昆仑雪菊降低了小鼠血糖值，升高了SOD活力，降低了MDA含量，清除了机体内的大量氧自由基，减轻了自由基对胰岛β细胞的损伤，从而增加胰岛素分泌，达到降低糖尿病小鼠血糖的目的。

糖尿病是复杂的多因素慢性疾病，从天然产物中寻找有效药物有积极意义，本研究证实了昆仑雪菊能够降低糖尿病小鼠血糖，有效成分可能是原花青素B2和绿原酸，其机制可能是提高体内抗氧化酶的活力，从而保护胰岛β细胞。但昆仑雪菊抗氧化的分子机制目前尚不清楚，有待进一步研究。