中红外光谱快速检测牛奶中土霉素的可行性研究

徐琛善，吴楠，海霞，王军，田佳，刘香檬，鲍振博，彭锦星



中红外光谱快速检测牛奶中土霉素的可行性研究

徐琛善，吴楠通信作者，海霞，王军，田佳，刘香檬，鲍振博，彭锦星

（天津农学院 工程技术学院，天津 300384）

将中红外光谱技术与偏最小二乘判别法相结合，建立一种牛奶中残留土霉素的快速检测方法。配置62个纯牛奶和62个掺杂有不同浓度土霉素（所掺土霉素浓度区间为0.02～30.00 mg/L）的牛奶样品，在400～4 000 cm-1区间进行中红外光谱采集。对原始光谱数据进行预处理之后，分别在全波段和分波段区间内建立偏最小二乘判别模型，并进行对比分析。结果显示，不同波数区间建模对掺杂土霉素牛奶的预判模型有较大影响。全波段和分波段区间所建模型对校正集样品的判别正确率均达 100%，预测集样品建模相关系数在0.995～0.997之间，表明所建模型的拟合效果良好，其中全波段和2 000～4 000 cm-1波段内所建模型对预测集样品的判别正确率均达90.0%。

牛奶；抗生素；中红外光谱；偏最小二乘判别分析

随着人们生活水平的提高，世界各地牛奶的消耗量持续增长。然而部分不合格牛奶中检测到的有害物质（如抗生素、三聚氰胺和尿素等）严重危害人体健康，引起消费者对牛奶食品安全的关注。土霉素属于四环素类抗生素，具有广谱抗病原微生物作用，是一种快速抑菌剂，高浓度时具有杀菌作用。土霉素类药物常被用于治疗奶牛的各种炎症，可导致牛奶中土霉素的残留。残留在牛奶中的土霉素可能引起人们过敏，或在牛奶食品加工过程中抑制发酵剂的活性，进而导致乳制品工业损失。目前，牛奶中抗生素残留物质的分析方法有很多种，如传统的微生物法、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）等。张俊升等[1]利用固相萃取前处理，结合高效液相色谱-二极管阵列检测器方法检测牛奶中土霉素、金霉素的残留量。汪善良等[2]比较了液相色谱-串联质谱与胶体金试纸条两种方法对牛奶中残留土霉素等四环素类药物的检测，检测限在40～80 μg/L之间。

虽然色谱及质谱技术在牛奶抗生素残留检测方面较为成熟，能达到较低的检测限，但前处理过程较复杂。近年来，光谱技术作为新兴的一种无损、快速检测技术，也被用于牛奶中抗生素残留检测，如近红外光谱法、中红外光谱法、荧光光谱法等。Sivakesava等[3]采用中红外（Mid infrared，MIR）和近红外（Near infrared，NIR）光谱法对牛奶中四环素进行了无损检测。在不同浓度范围内（4～520，520～2 000和4～2 000 μg/L）分别建模，并进行对比分析，验证模型的相关系数R为0.61～087，研究发现，中红外法检测牛奶中四环素的预测误差要低于近红外法。Wu等[4]用近红外光谱法对牛奶中残留的四环素进行了定性和定量分析，校正集和预测集的正确判别率分别达到100.0%和96.3%。由于红外光谱技术不需要复杂的样品前处理，操作简单，成本低，可对样品实现原位检测，也被广泛用于乳制品中其他掺杂物质（如三聚氰胺）的检测[5]。

偏最小二乘判别分析法（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，根据实际测量出的众多变量值，来判断研究对象如何分类。通过对不同处理样本（如观测样本、对照样本）的特性分别进行训练，产生校正集，并检验校正集的准确率。本文采用中红外光谱结合偏最小二乘判别法对牛奶中残留的土霉素进行检测，建立土霉素掺杂牛奶和纯牛奶的判别模型，并研究不同波数建模区间对判别模型的影响。

1 材料与方法

1.1 样品处理

样品为在网上超市购买的某品牌同一批次的纯牛奶。土霉素标品粉末购自Solarbio（纯度＞99%）。配制31个不同浓度梯度的土霉素掺杂牛奶，质量浓度分别为0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、18、20、25、30 mg/L。每个浓度梯度设2个重复，共62个样品。同时准备62个纯牛奶样品。用中红外仪器对这124个样品的光谱数据进行采集。

1.2 光谱采集

采用美国 PerkinElmer 公司的傅里叶变换中红外光谱仪，样品池为仪器自配的衰减全反射附件。中红外光谱的扫描范围为 400～4 000 cm-1，分辨率为 4 cm-1，扫描间隔为8 cm-1，扫描次数为 8次，每个浓度样品测量两次。

1.3 分析方法

利用unscrambler分析程序，对输入的掺杂牛奶光谱数据进行多元散射校正，采用 Savitzky- Golary 方法对原始光谱数据进行平滑预处理，以减少对判别模型的干扰。然后采用PLS算法的Matlab程序包建立掺杂土霉素牛奶的判别模型。利用交互验证（cross-validation）的方法来确定模型的最佳主成分数，利用测定值与模型计算值之间的建模相关系数（），内部交叉验证均方差（Root mean square errors of cross validation，RMSECV），预测相关系数（），预测均方差（Root mean square errors of prediction，RMSEP）等指标评定模型的质量[5]。

2 结果与分析

2.1 纯牛奶和掺杂土霉素牛奶的中红外光谱图

图1是纯牛奶和掺杂土霉素牛奶样品的中红外光谱图。整个光谱范围内，掺杂牛奶和纯牛奶谱峰出现的位置基本相同，大致出现在1 080 cm-1和2 920 cm-1左右，看不出掺杂土霉素的明显特征。这表明简单的通过光谱形状和谱峰位置很难判别牛奶中是否掺杂土霉素，故需要进一步借助化学计量学方法来进行判别。

图1 纯牛奶和掺杂土霉素牛奶的中红外光谱图

2.2 全波段分析

对主成分数的设定会直接影响PLS-DA的建模结果，如果设定的主成分数过高，会引入一些无用信息，同时延长建模时间；如果设定的主成分数过低，则可能因为缺失一些有用信息而导致模型预测能力降低[6]。由于主成分分析依赖所给数据，所以数据的准确性对分析结果影响也很大，因此分析之前剔除了数据中的异常值。图2是PLS-DA模型的随主成分数变化的散点图。从图2可以看出，主成分数为5时建立判别模型的为最小，因此本试验PLS-DA模型建立的主成分数选择为5个。

图2 PLS-DA模型RMSECV随主成分数的变化曲线

由于异常样本会影响PLS-DA模型的稳健性和预测精度[5]，本研究根据样本在主成分得分散点图上的分布，剔除6个样品异常值之后建立模型。对剩余的118个样品按照2∶1的比例分为2组，随机选择78个样品作为校正集（掺杂牛奶和纯牛奶样品各39个），剩余的40个样品作为预测集（掺杂牛奶和纯牛奶样品各20个），如表1所示。

表1 建立PLS-DA模型的校正集和预测集样品分配

本试验在全波段（400～4 000 cm-1）范围内对校正集78个样品数据建立掺杂土霉素牛奶的判别模型（图3）。PLS-DA分析中，变量为类别变量，对于两类判别，掺杂土霉素牛奶和纯牛奶的变量值分别设定为 1 和 0。当某一样品预测值大于0.5 时，判定样品为掺杂类，而当某一样品预测值小于 0.5 时，判定样品为未掺杂（纯牛奶）类[5]。图3是掺杂土霉素牛奶的PLS-DA模型对校正集的内部样品的预测结果。结果表明，对于土霉素掺杂与否的判别正确率达到100%。

图3 PLS-DA模型对校正集内部样品的预测结果

为了验证所建立PLS-DA模型的判别能力和准确性，用未参与建模的预测集40个样品对该模型进行验证。表 2 是模型对预测集样品进行预测后的预测值及判别结果。结果表明，在全波段 （400～4 000 cm-1）范围内，40个样品中共有4个样品被误判，其中2个纯牛奶被误判为掺杂土霉素牛奶， 2个掺杂牛奶被误判为纯牛奶。所建立模型的判别正确率为90.0%，预判结果良好。

表2 PLS-DA模型对预测集样品的判定结果

2.3 分波段分析

光谱范围对建立模型的性能和预测准确性有很大的影响，因此选择合适的光谱波段建立模型非常重要。本文选取了2个不同的波数区间，即400～2 000 cm-1和2 000～4 000 cm-1分别建立了PLS-DA模型。表 3 给出了分波段和全波段区间下所建判别模型对校正集和预测集样品的判别结果。由表3可知，2个分波段建模的主成分数都为4，用全波段建模的主成分数为5。利用校正集建立模型对牛奶是否掺杂土霉素进行判别时，不论是分波段还是全波段，模型的判别准确率都达到100%。波段为400～2 000 cm-1时，校正集建模相关系数较低（＝0.862），其余2个波段的建模相关系数均超过0.900。波段为2 000～4 000 cm-1时，模型的最低，为0.354 3 mg/L。通过预测集验证模型，3个不同建模波段的相关系数在0.995到0.997之间，表明所建模型的拟合效果良好。波段为2 000～4 000 cm-1时，模型的相关系数最高，也比其他2个波段要高。波段为400～2 000 cm-1时，模型对预测集样品掺杂与否的判别准确率为87.5%，而其他2个波段所建模型对样品掺杂与否的判别准确率均为90.0%。总体分析，全波段和2 000～4 000 cm-1波段内的PLS-DA建模效果要优于400～2 000 cm-1波段。上述结果表明，不同波数区间建模对掺杂土霉素牛奶的预判模型有较大影响。

表3 基于分波段和全波段的PLS-DA模型的校正预测分析结果

3 结论

本研究利用中红外光谱法对纯牛奶中掺杂的土霉素（所掺土霉素质量浓度为0.02～30 mg/L）进行检测。在全波段区间所建的PLS-DA模型对78个校正集样品的判别正确率为 100.0%，对40个预测集未知样品的判别正确率为90.0%。分别在分波段和全波段区间下建立模型对预测集样品进行判别，建模相关系数在0.995到0.997之间，表明所建模型的拟合效果良好。其中全波段和2 000～4 000 cm-1波段内所建模型对预测集样品的判别正确率均达到90.0%，优于400～2 000 cm-1波段的判别正确率87.5%。研究表明，基于中红外光谱的检测方法可为无损检测牛奶中是否掺杂土霉素等抗生素提供一种快捷简单的方法。尽管本研究只对抗生素掺杂牛奶做了定性分析，但该方法可以初步判断牛奶中是否含有抗生素，作为高效液相色谱法的补充，并提高检测效率。

[1] 张俊升，李亚琳，王钦晖，等. 固相萃取-高效液相色谱-二极管阵列检测器测定牛奶中土霉素、金霉素的残留量[J]. 中兽医医药杂志，2006，25（5）：30-32.

[2] 汪善良，吴鹏，刘琳，等. 胶体金试纸条法和液相色谱-串联质谱法检测牛奶中四环素类药物残留比较[J]. 乳业科学与技术，2011，34（6）：268-271.

[3] Sivakesava S，Irudayaraj J. Rapid determination of tetracycline in milk by FT-MIR and FT-NIR spectroscopy[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（3）：487-493.

[4] Wu N，Xu C S，Yang R J，et al. Detection of tetracycline in milk using NIR spectroscopy and partial least square[J].IOP Conference Series：Earth and Environmental Science，2018，113：012004.

[5] 杨仁杰，刘蓉，徐可欣. 基于近红外光谱对牛奶中掺杂尿素的判别分析[J]. 食品科学，2012，33（16）：120-123.

[6] 廖彩淇，孙长虹，杨潇，等. 基于近红外光谱红茶中胭脂红色素的判别[J]. 天津农学院学报，2018，25（1）：72-75.

责任编辑：杨霞

Feasibility of rapid detection of oxytetracycline in milk by mid-infrared spectroscopy

XU Chen-shan, WU NanCorresponding Author, HAI Xia, WANG Jun, TIAN Jia, LIU Xiang-meng, BAO Zhen-bo, PENG Jin-xing

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The method for rapid detection of oxytetracycline residues in milk was established by combining mid-infrared （MIR） spectroscopy with partial least squares discriminant analysis（PLS-DA）. Firstly, 62 pure milk samples and 62 milk samples adulterated with different concentrations of oxytetracycline（0.02-30.00 mg/L）were prepared respectively. The MIR spectra of all samples were collected in the range of 400-4 000 cm-1. After the pretreatment of original spectral data, the PLS-DA models were established in the full band and sub band ranges, respectively. The results show that different wave-number ranges had a great influence on the prediction model of milk adulterated with oxytetracycline. The classification accuracies of the constructed PLS-DA models were 100% for calibration set in the full band and sub band ranges, and the correlation coefficients of models were between 0.995 and 0.997 for prediction set, which shows that the models had a good fitting effect. The classification accuracies of constructed models in the full band and in the range of 2 000-4 000 cm-1were 90.0% for prediction set.

milk; antibiotics; mid-infrared spectroscopy; partial least squares discriminant analysis

1008-5394（2018）03-0070-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.015

0657.33

A

2018-06-19

国家自然科学基金项目（21607114，41771357）；大学生创新创业训练计划项目（201810061206）

徐琛善（1996－），男，本科在读，主要从事环境与新能源方面的研究。E-mail：1209148248@qq.com。

吴楠（1984－），女，讲师，博士，主要从事环境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。