犬附红细胞体PGK的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

宋淇淇，钱丽敏，苏苗，于晓雪，秦顺义，龚岳



犬附红细胞体PGK的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

宋淇淇1，钱丽敏1，苏苗1，于晓雪1，秦顺义1，龚岳2

（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 天津市滨海新区塘沽动物卫生监督所，天津 300354）

为了原核表达、纯化犬附红细胞体磷酸甘油酸激酶（PGK），并制备多克隆抗体，本试验从NCBI中已公布的犬附红细胞体（）全基因组序列中，调取其磷酸甘油酸激酶（PGK）的基因序列，并选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，插入质粒pET32a（＋）中，构建重组表达质粒pET32a（＋）-pgk，转化BL21（DE3）感受态细胞，用IPTG诱导表达，利用Western-blot方法检测表达产物，表达产物经镍离子亲和层析纯化后免疫昆明小鼠，获得鼠抗犬附红细胞体PGK多克隆抗体，并利用间接ELISA法检测血清抗体效价。结果表明：成功构建了pET32a（＋）-pgk原核表达载体，并在BL21中得以诱导表达，重组蛋白相对分子质量约为60 ku，在包涵体和上清中均有表达，经镍离子亲和层析获得了纯度较高的目的蛋白，利用纯化后的蛋白所制备的鼠抗血清效价可达1∶51 200。

犬附红细胞体；磷酸甘油酸激酶；原核表达；纯化；多克隆抗体

附红细胞体病是由附红细胞体寄生于人或动物红细胞表面、血浆、骨髓等处而引起的一种人畜共患病，临床上以发热、贫血、黄疸为主要特征。1928年，Schilling和Dinger等首次报道了啮齿类动物红细胞中的附红细胞体。随后，绵羊、牛、猪红细胞上的附红细胞体相继被发现。1986年，人类附红细胞体病正式由Puntaric等报道[1]。犬附红细胞体（） 最早由Kiluth于1928年在德国发现，而在我国，全炳昭于1990年首次报道了犬附红细胞体病，次年华修国等在上海发现了此病[2-4]。随着人民生活水平的提高，宠物业飞速发展，犬附红细胞体病的分布日益广泛，引起了人们的广泛关注。

犬附红细胞体的全基因组信息于2011年被公布并注释，经分析，此类病原体内缺乏丙酮酸脱氢酶复合体，其利用糖酵解途径进行主要的能量代谢[5-6]。磷酸甘油酸激酶 （phosphoglyceric kinase，PGK）是生物体糖酵解过程中的关键酶类，它催化1，3-二磷酸甘油酸（1，3-diphosphogly cerate）转变成3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate 3-PG），在这过程中消耗一分子的ADP，产生一分子的ATP。经报道，糖酵解途径是锥虫在血流期唯一的能量来源，而锥虫的PGK是一个重要的潜在药物设计靶标[7]。而在华支睾吸虫中，PGK则证实主要分布在表皮和肌肉组织[8]。日本血吸虫的PGK重组蛋白经证实可在小鼠体内诱导部分免疫性保护作用，且此蛋白大量存在于血吸虫的体被表膜中[9]。尽管PGK在以上所述的多种寄生虫中均有报道，但在附红细胞体中的研究却为空白。

本研究根据NCBI上已公布的犬附红细胞体PGK蛋白基因序列，化学合成并且连接表达载体后进行原核表达，纯化表达的重组蛋白并且制备多克隆抗体血清，为研究PGK在犬附红细胞体中的作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及主要试剂

质粒pET-32a（＋） 购自Novagen生物工程公司；Trans5αChemically Competent Cell、BL21 （DE3） Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司。

限制性内切酶、T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司（Takara）；DNA Marker、镍亲和层析介质（ProteinPure Ni-NTA Resin）购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白质分子质量标准购自Thermo公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技研究所。HRP标记山羊抗鼠IgG购自索莱宝有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。

1.2 基因序列的化学合成及重组表达载体的构建

从NCBI中已公布的犬嗜血性支原体（）全基因组序列中，调取其PGK的基因序列，其基因全长为1 227 bp。考虑到支原体密码子的特殊性（UGA在支原体中编码色氨酸，而在大肠杆菌中则为终止密码子），需将基因序列中所有UGA密码子处突变为UGG。因此本试验采用化学合成的方法合成新的基因序列，并选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列，以使其能顺利的在原核表达系统中进行表达。

合成的基因5＇端加HⅠ酶切位点，3＇端加Ⅲ酶切位点。对载体pET-32a（＋）进行HⅠ和Ⅲ双酶切，与目的基因连接后转化大肠杆菌5α感受态细胞，挑取单个菌落后提取质粒进行双酶切鉴定，获取阳性重组质粒（pET-32a-pgk）。

1.3 重组蛋白的诱导表达

将构建好的重组表达质粒pET-32a-pgk转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落，接种于3 mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃摇床中180 r/min振荡培养过夜；将过夜培养的菌液按1∶100比例转接入5 mL新鲜的氨苄抗性液体培养基中。于37 ℃摇床中180 r/min振荡培养2.5～3.0 h，直至600值达到0.7左右；将培养后的菌液加入IPTG诱导剂至终浓度为1 mmol/L；37 ℃摇床中180 r/min继续振荡培养3～4 h；将振荡培养完成之后的菌液分别取1 mL转入1.5 mL EP管中，8 000 r/min离心2 min收集菌体；将每管菌体沉淀用ddH2O或PBS重悬后加入上样缓冲液后充分涡旋，于沸水中煮10 min，之后立即转入冰上静置5 min。处理之后的蛋白样品可以直接用于SDS-PAGE电泳检测或者置于-20 ℃保存备用。

1.4 重组蛋白表达形式的确定

将按1.3所述方法诱导表达的菌液取1.5 mL于8 000 r/min离心2 min收集菌体，用ddH2O或PBS反复洗涤菌体2～3次；将菌体溶液置于冰水混合物上用超声破碎仪进行破碎，15 s/次，间隔30 s，每管破碎8～10次，直至液体澄清具有透光性；将已破碎好的样品于4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min。分别取上清溶液及沉淀加入适量上样缓冲液后充分涡旋混匀。将所有样品在沸水中煮10 min，之后立即转入冰上静置5 min。处理之后的样品经SDS-PAGE检测观察结果。

1.5 重组蛋白的纯化

参照北京全式金公司镍亲和层析介质（ProteinPure Ni-NTA Resin）蛋白纯化说明书进行蛋白纯化，具体方法如下：将1 L诱导表达的细菌培养物于4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，弃去上清。将沉淀用1/10体积的平衡缓冲液（20 mmol/L磷酸钠，调节pH至7.0）重悬后，用压力破碎仪破碎至液体澄清；于4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min。若目的蛋白存在于上清中，则上清可直接用于上柱；若目的蛋白存在于包涵体中，则此步弃去上清，将沉淀用一定量的包涵体平衡缓冲液室温作用2 h，或4 ℃作用过夜，直至沉淀溶解；用5～10倍柱体积平衡缓冲液平衡层析柱；将处理后的上清成分或者包涵体溶解液经微滤后上柱；用5～10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱；用不同浓度咪唑溶液洗脱目的蛋白，按咪唑浓度由低到高进行梯度洗脱，每个浓度的洗脱体积为1～2倍柱体积，收集洗脱液；将镍柱纯化过程中各步骤所得到的溶液各取40 μL，用上样缓冲液进行处理后进行SDS-PAGE电泳，检验蛋白纯化效果；根据跑胶结果将有单一目的蛋白带的洗脱液集中倒于处理过的透析袋中，在4 ℃条件下于PBS中透析后浓缩，测定蛋白浓度后分装于小管置于-80 ℃保存备用。

1.6 重组蛋白的Western-blot检测

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上，转印后的膜置于封闭液中封闭1 h；一抗为鼠抗His单克隆抗体（按1∶100稀释），于37 ℃反应1 h；用PBST洗膜三次；二抗为山羊抗小鼠IgG抗体（按1∶1 000稀释），于37 ℃反应1 h；用PBST洗膜3次；最后用DAB显色液进行显色，同时设诱导前的蛋白作为对照。

1.7 多克隆抗体的制备

首免采用抗原与弗氏完全佐剂乳化后免疫小鼠，免疫剂量为50 μg/只，首免后21 d用抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行二免，免疫剂量减半，之后加强免疫每次免疫间隔为10 d，三免后七天尾部少量采血测抗体效价。免疫程序结束后，采用眼眶采血法最大限度的收集小鼠血清。

1.8 多克隆抗体效价的鉴定

用包被液将蛋白抗原稀释至5 ng/μL，以100 μL/孔包被酶标板，4℃过夜；取出ELISA板，甩干，加入PBST洗涤液180 μL，静置3 min，甩干，如此洗涤3次；以150 μL/孔加入封闭液（3% BSA），37 ℃温育45 min，甩干后拍干；以100 μL/孔加入倍比稀释的多抗血清，稀释度为1∶100至1∶51 200，同时设立阴性（免疫前小鼠血清）及空白对照，37 ℃温育1 h，PBST洗涤3次；以100 μL/孔加入适当稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，37℃温育1 h，PBST洗涤4次；以100 μL/孔加入TMB底物显色液，室温避光静置10 min；以50 μL/孔加入0.25%HF终止液结束反应，用酶标仪测定630nm值，进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体的鉴定

将基因与pET-32a（＋）载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单个菌落后提取质粒用HⅠ和Ⅲ进行双酶切鉴定，得到大小约为5 900 bp和1 200 bp两条带，与预期结果一致。酶切结果见图1。

图1 重组表达载体的酶切鉴定

注：M为DNA分子质量标准；1、2、3为pET-32a-pgk经HⅠ和Ⅲ双酶切的结果

2.2 重组蛋白的表达及可溶性分析

取l mL诱导后的菌液经离心收集菌体，用ddH2O或PBS洗涤后加入上样缓冲液，煮沸后经SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果见图2，与未诱导组相比，诱导组在60 ku左右可见清晰的目的条带，其大小与理论值相符。

图2 重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果

注：M为蛋白质分子质量标准；1为未诱导的重组菌；2为诱导后的重组菌；3为超声裂解后的上清液；4为超声裂解后的沉淀

将诱导后的菌液经超声破碎处理后，分别取上清溶液及沉淀加入适量上样缓冲液，煮沸经SDS-PAGE分析（见图2）。可见目的蛋白条带在上清液和沉淀中均有表达，表明部分目的蛋白是以可溶性形式进行表达。

2.3 重组蛋白的纯化结果

取目的蛋白的可溶性表达成分进行纯化，纯化结果见图3，纯化后的重组蛋白可见分子质量为60 ku的目的条带，未见其他明显条带，表明获得了浓度和纯度都较高的目的蛋白。

图3 重组蛋白的纯化结果

注：M为蛋白质分子质量标准；1为诱导后超声裂解的上清液；2为纯化后的表达产物

2.4 重组蛋白的Western-blot检测结果

重组蛋白的Western-blot结果显示，诱导后的重组菌在60 ku处可见阳性条带，而诱导前的样品则无条带（图4）。说明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

图4 重组蛋白的Western-blot分析结果

注：M为蛋白质分子质量标准；1为诱导前pET-32a- pgk重组菌；2为诱导后pET-32a-pgk重组菌

2.5 多克隆抗体的鉴定结果

以纯化的PGK蛋白包被ELISA板，采用间接ELISA方法检测制备的免疫血清效价，结果显示，免疫后的多克隆抗体血清的效价可达1∶51 200。

3 讨论

犬附红细胞体病近年在许多国家发现并报道，其中包括美国、坦桑尼亚、瑞士、希腊以及意大利、西班牙、葡萄牙等地中海国家，其阳性率为0.6%～40.0%[10-14]。而在我国，关于犬附红细胞体病的报道主要集中在诊断方法的建立[15-17]及形态学研究[18-19]。随着犬附红细胞体全基因组测序的完成，此病原的许多功能性蛋白基因序列得以公布，使得对此病原的进一步深入研究成为可能。

由于犬附红细胞体在分类上属于支原体，其密码子的使用与大肠杆菌不完全相同[20]。具体来说，UGA在支原体中编码色氨酸，而在大肠杆菌中则为终止密码子，因此直接从阳性样品中扩增出的犬附红细胞体基因序列并不适用于构建原核表达载体，若要顺利进行原核表达，则需要将基因序列中所有三联密码子为TGA处突变为TGG。因此本试验直接采用化学合成的方法合成新的基因序列，并选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列，以使其顺利地在原核表达系统中表达。

糖酵解途径中的PGK在多种寄生虫中不仅参与能量的产生，还定位于虫体表膜，具有一定的免疫学保护作用，可能是潜在的药物靶标。本研究选择犬附红细胞体PGK作为研究对象，利用化学合成的基因序列成功构建原核表达载体，并顺利表达出重组蛋白，利用纯化后的重组蛋白制备出了效价达1∶51 200的多克隆抗体血清，为研究PGK在犬附红细胞体中的作用打下基础。

[1] Puntaric V，Borcic D，Vukelic D，et al.in man[J]. Lancet，1986，11：868-869.

[2] Sykes J E，Ball L M，Bailiff N L，et al.‘Mycoplasma haematoparvum’，a novel small haemotropic mycoplasma from a dog[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2005，55（1）：27-30.

[3] 全炳昭，谢才丰. 犬的附红细胞体病及其诊疗报告[J]. 中国实验动物学杂志，1991，1（2）：119-120.

[4] 华修国，张秀根，李中夏. 犬附红细胞体病[J]. 中国动物检疫，1992，9（3）：30-31.

[5] do Nascimento N C，Guimaraes A M S，Santos A P，et al. Complete genome sequence ofstrain Illinois[J]. Journal of Bacteriology，2012，194（6）：1605-1606.

[6] Santos A P，Guimaraes A M S，do Nascimento N C，et al. Genome of，unraveling its strategies for survival and persistence[J]. Veterinary Research，2011，42：102-117.

[7] Opperdoes F R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes[J]. Annu Rev Microbiol，1987，41：127 -151.

[8] Hong S J，Seong K Y. Molecular cloning and immunological characterization of phosphoglycerate kinase from[J]. Mol Biochem Parasitol，2000，108：207-216.

[9] 黄莉妮. 日本血吸虫磷酸甘油酸激酶SjPGK基因的克隆表达及生物学特性的初步探索[D]. 南京：南京农业大学，2012.

[10] Barker E N，Tasker S，Day M J，et al. Development and use of real-time PCR to detect and quantifyand“Mycoplasma haematoparvum”in dogs[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（1）：167-170.

[11] Compton S M，Maggi R G，Breitschwerdt E B.Mycoplasma haematoparvum andinfections in dogs from the United States[J]. Comparative Immunology，Microbiology and Infectious diseases，2012，35（6）：557-562.

[12] Novacco M，Meli M L，Gentilini F，et al. Prevalence and geographical distribution of canine hemotropic mycoplasma infections in Mediterranean countries and analysis of risk factors for infection[J]. Veterinary Microbiology，2010，142（3）：276-284.

[13] Tennant K V，Barker E N，Polizopoulou Z，et al. Real-time quantitative polymerase chain reaction detection of haemoplasmas in healthy and unhealthy dogs from Central Macedonia，Greece[J]. Journal of Small Animal Practice，2011， 52（12）：645-649.

[14] Wengi N，Willi B，Boretti F S，et al. Real-time PCR- based prevalence study，infection follow-up and molecular characterization of canine hemotropic mycoplasmas[J]. Veterinary Microbiology，2008，126（1）：132-141.

[15] 夏晓辉，丁晓双，张晓轩，等. 犬附红细胞体PCR检测方法的建立及应用[J]. 畜牧与兽医，2013，45（3）：81-84.

[16] 张伟，刁有祥，臧大鹏，等. 犬附红细胞体病PCR检测方法的建立及应用[J]. 西南师范大学学报（自然科学版），2009，34（1）：67-71.

[17] 周勇志，李庄，石磊，等. 犬附红细胞体PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医寄生虫病，2008，16（4）：1-4.

[18] 车京波. 犬附红细胞体病形态学研究及PCR快速诊断方法的建立与应用[D]. 泰安：山东农业大学，2007.

[19] 薛慧亮. 犬附红细胞体形态学观察及PCR诊断方法的建立[D]. 长春：吉林大学，2014.

[20] Neimark H，Johansson K E，Rikihisa Y，et al. Proposal to transfer some members of the generaandto the genuswith description of‘Mycoplasma haemofelis’，‘Mycoplasma heamomuris’，‘Mycoplasma haemosuis’and‘Mycoplasma wenyonii’[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2001，51：891-899.

责任编辑：张爱婷

Prokaryotic expression and purification ofphosphoglyceric kinase and the preparation of its polyclonal antibodies

SONG Qi-qi1, QIAN Li-min1, SU Miao1, YU Xiao-xue1, QIN Shun-yi1, GONG Yue2

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tanggu Animal Health Supervision Institute, Binhai New District, Tianjin 300354, China）

In order to express and purify phosphoglyceric kinase （PGK） of, and prepare its polyclonal antibodies, the information of PGK gene sequence was obtained from the publishedgenome on NCBI. The modified PGK gene sequence was synthesized chemically according to the prokaryotic cells-preferred codon, and inserted into pET32a（+）. The constructed recombinant plasmid pET32a（+）-pgk was transformed toBL21（DE3）competent cells, and induced with IPTG. The expression product was detected by Western-blot, and then purified by Ni-affinity purification column. The purified recombinant protein was used to immune Kunming mice and to produce the polyclonal antibodies. The serum antibody titer was determined by indirect ELISA. The results showed that recombinant plasmid pET32a（+）-pgk was constructed correctly, and successfully expressed in BL21. The relative molecular mass of recombinant protein was about 60 ku. And the protein was existed in both inclusion bodies and supernatant. The high-purified recombinant protein was obtained by Ni-affinity purification column, and the prepared mice antiserum reached a titer of 1∶51 200.

; phosphoglyceric kinase; prokaryotic expression; purification; polyclonal antibodies

1008-5394（2018）03-0042-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.009

S852.62

A

2018-04-28

天津农学院科学研究发展基金项目（2014N10）；国家自然科学基金项目（31702223）；天津农学院附属动物医院委托项目（科经第2018.96号）

宋淇淇（1986-），女，讲师，博士，主要从事兽医寄生虫学教学及研究工作。E-mail：qqs0606@163.com。