纳米淡水珍珠粉的制备及生物学实验评价

毛秋华 徐 普 程亚楠 廖 军 陈 灵 邢 璐 李木元

珍珠主要是由约95%多晶体碳酸钙（纳米级碳酸钙晶粒构成）和不到5%有机质构成，具有天然骨相类似结构，国内外大量研究证实珍珠具有良好的生物相容性和骨诱导作用，而纳米级珍珠粉生物降解性和骨生成作用更突出[1～5]。

纳米材料是指由处于一定尺度范围（1nm～100nm）内的纳米颗粒及其致密的聚集体，或由纳米微晶体所构成的具有表面效应、量子（小）尺寸效应和量子隧道效应等一系列特殊效应的材料[6]，由于其粒子尺寸小、比表面积大、化学活性高等优良特性使其具有广泛的应用前景，许多在一般条件没有生物毒性的物质，在纳米粒度尺寸下可以表现出很强的生物毒性，而不同纳米材料类型、形态、浓度和制备方法等毒性作用也可能不一样，因此，有必要对每一种纳米材料的生物相容性进行实验研究。

本研究参照国家医疗器械生物学评价标准GB/T 16886，选择细胞毒性试验、溶血试验、皮内反应试验和急性毒性试验对研磨制备的纳米级淡水珍珠粉的生物相容性进行了初步实验研究。

资料和方法

一、实验细胞、动物与材料

1.细胞株

L929细胞（小鼠成纤维细胞），由上海中科院细胞库提供。

2.实验动物

SD大鼠16只，雌性，体重180～220g；健康新西兰白兔3只，雌雄不限，体重2kg～2.5kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。

3.主要材料与仪器

材料：微米级淡水珍珠粉（海南京润珍珠生物技术股份有限公司）；MTT、二甲基亚砜、0.25%胰蛋白酶溶液等试剂（Sigma公司，美国）；DMEM培养基、胎牛血清、青-链霉素（Gibco公司，新西兰）；磷酸盐缓冲液1×10（索莱宝）；苯酚（分析纯，广州市番禺力强化工厂）。

仪器：立式双轴纳米陶瓷砂磨机（KLLN-1，深圳市科力纳米工程设备有限公司）；台式低速离心机（KDC-40，安微中科中佳科学仪器有限公司）；电子分析天平（Ohaus，美国；JE-01，上海浦春）；CO2细胞培养箱（Sanyo，日本）；酶联免疫检测仪（Thermo MK3，美国）；紫外分光光度仪（Bio-Rad 美国）；高分辨透射电子显微镜（JEM-2100，日本）。

二、实验方法

1.制备纳米级淡水珍珠粉

将微米级淡水珍珠粉与无水乙醇以重量体积比（g/ml）约为1：15的比例在砂磨机中研磨2h，干燥，利用透射电子显微镜观测珍珠粉的粒径。

2.制备样品浸提液

纳米珍珠粉-DMEM培养液浸提液制备：将纳米珍珠粉浸在DMEM培养液（10%胎牛血清）中，样品重量与浸提液的体积按0.2g/ml计算，37℃恒温箱中浸提 24h，离心（3500rpm，10min），吸取上清液，0.22μm过滤器过滤除菌，配制成100%、50%、25%、12.5%浓度的材料浸提液，4℃保存备用。

纳米珍珠粉-生理盐水浸提液制备：将纳米珍珠粉浸在生理盐水中，样品重量与浸提液的体积按0.2g/ml计算，37℃恒温箱中浸提72h。

3.细胞毒性实验

方法：0.25%胰酶消化L929细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为4×104个/mL，取96孔培养板，每孔加入200μL细胞悬液，置入37℃、5%CO2培养箱中培养24h。细胞贴壁后，弃去培养板内旧培养液，实验组分四个浓度组，各组每孔分别加入100%、50%、25%、12.5%的纳米珍珠粉-DMEM培养液浸提液200μL，并设空白对照组（200μL，含10%胎牛血清的DMEM培养液）和阳性对照组（200μL，0.64%苯酚），每组各8个复孔，置入37℃、5%CO2培养箱中培养72h，加人 5mg/ml的MTT溶液20μL，于5%C02、37℃继续培养4h，吸除原液，再加入150μL/孔二甲基亚砜（DMSO），室温下在96孔微震摇器上震荡l0min，待蓝紫色结晶溶出后，使用酶联免疫检测仪测定490nm OD值，根据各组OD值计算各实验组细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR＝实验组或阳性对照组的平均OD值/阴性对照组的平均OD值×l00%。

材料细胞毒性判断标准：0级为≥100%，1级为75%～99%，2级为 50%～74%，3级为 25%～49%，4级为1%～24%，5级为0。

4.溶血试验

方法：取健康成年人肘部静脉血10mL，加入到含有抗凝肝素钠的试管中，制备新鲜抗凝血，取8mL，加生理盐水10mL稀释备用。实验分为3组，每组取3个试管，每组各管分别加入纳米珍珠粉生理盐水浸提液10mL（实验组）、同批号生理盐水10mL（阴性对照组）和蒸馏水10mL（阳性对照组）。全部试管放入37℃恒温箱中30min后，每管加稀释血0.2mL，轻轻混匀，置37℃恒温箱中继续保温60min。2500rpm离心5min，取每管上清液，分光光度仪测取545nm处的OD值，取平均值计算溶血率（hemolysis rate，HR）。HR＝（实验组OD值-阴性对照组OD值）/（阳性对照组OD值-阴性对照组OD值）×100%。

结果评定：若HR＞5%，则表示材料有溶血作用；若HR＜5%，说明材料符合生物材料的溶血试验要求。

5.皮内刺激试验

方法：取新西兰白兔3只，在每只兔脊柱两侧各作8个点皮内注射，每侧相邻点间隔约2cm，其中左侧每个点注射0.2ml珍珠粉生理盐水浸提液，右侧每个点注射0.2ml生理盐水作为对照，注射后即刻，4h、24h、48h和72h观察记录各注射部位状况。

评分：按皮肤反应评分系统对每个注射部位的红斑和水肿组织反应进行评分，计算局部原发刺激指数（primarily stimulation index，PII）。

6.急性全身毒性试验

方法：选用体重180g～220g雌性SD大鼠16只，随机分为2组，每组8只，分笼饲养，各组大鼠标记编号，称重。每只大鼠腹腔内按20mL/kg剂量，实验组注射纳米珍珠粉生理盐水浸提液，对照组注射生理盐水。

结果观察：注射后24h、48h和72h观察记录所有SD大鼠的进食、活动及有无死亡等一般状况，并对每只大鼠进行称重。7d后，颈椎脱臼法处死动物，解剖暴露腹腔，观察大鼠腹腔有无粘连，取动物肝、脾、肾脏行组织学检查。

结 果

1.研磨后珍珠粉粒径的透射电镜观测

研磨后珍珠粉的透射电镜图可以看出，珍珠粉颗粒形态多样，颗粒间有团聚，颗粒大小不均，但是基本都在100nm以下（图1）。使用Nano Measurer 1.2软件对珍珠粉透射电镜图片中的颗粒（至少200个）进行测量，颗粒粒径以近似等效圆形的直径进行估算。用SPSS 17.0对珍珠粉粒径进行单样本K-S检验，P＜0.05，即珍珠粉粒径分布不属于正态分布，它的算术平均粒径为37.45nm，中位数为34.72nm，极大值为83.65nm。按照我国和欧盟对纳米材料的要求[7，8]，研磨后的珍珠粉颗粒平均粒径小于100nm，符合纳米材料的标准。

图1 研磨后的珍珠粉透射电镜观察

2.细胞毒性实验

表1为加样3d后各组平均OD值、相对增殖率、细胞毒性等级，从表可以看出，纳米珍珠粉浸提液各浓度组细胞增殖率都小于阴性对照组，浓度越高增殖率越低，但各实验组细胞毒性均在I级，符合国家医用生物材料的细胞毒性要求。利用SPSS 17.0统计软件，将各组OD值进行单因素方差分析，结果显示，纳米珍珠粉各浓度组与阴性对照组之间差异有统计学意义（P＝0＜O.05）。

表1 纳米珍珠粉对L929细胞增殖的影响及细胞毒性

3.溶血试验

实验组及阴性对照组各管离心后上层均为清亮无色液体，下层为红细胞沉淀物；阳性对照组各管离心后，上层液体为红色。实验组的溶血率为1.01%。该材料的溶血率小于5%，符合组织工程材料溶血试验要求。

4.皮内刺激试验

将纳米珍珠粉浸提液注射于兔背部皮内后，4h时各注射部位皮丘消失，可见个别注射后静脉创伤淤血点，其余无异常。在24h、48h、72h各观察时间点注射部位皮肤无红斑和水肿表现，按GB/T 16886皮肤反应评分系统，PII为0，属于无刺激反应类型，表明纳米珍珠粉浸提液不引起皮内刺激反应。

5.急性全身毒性试验

将纳米珍珠粉浸提液经SD大鼠腹腔注射后，1w内所有大鼠活动未见异常，进食正常，未见呕吐、腹泻，大便无异常，无惊厥、瘫痪和死亡等见毒性表现。于24h、48h、72h称重，所有的大鼠体重都有不同程度增加，随时间延长呈增长趋势（表2），经SPSS 17.0统计分析，将实验组和对照组各时间段体量增加量进行t检验，无统计学差异（P＞0.05）。7d后解剖观察所有大鼠腹腔内无积液、无粘连，内脏无充血、水肿、结节形成，肝、脾、肾大体观察和组织学检查未见异常。

表2 急性全身毒性试验中大鼠体量增加结果（±s，n=8，单位：g）

表2 急性全身毒性试验中大鼠体量增加结果（±s，n=8，单位：g）

实验组和对照组各时间点比较：AP＝0.462＞0.05；BP＝0.651＞0.05；CP＝0.148＞0.05

组别 动物数 观察时间（h）24hA 48hB 72hC实验组对照组8 8 3.37±1.39 3.61±0.43 6.14±2.16 6.69±1.08 9.56±2.44 9.73±1.81

讨 论

体外细胞毒性试验可以评价医疗器械和生物材料是否存在潜在性的致细胞毒性反应。L929细胞，来自永生细胞系小鼠成纤维细胞，是国际公认的应用于体外细胞毒性实验评价的细胞系[9]。本研究中体外细胞毒性试验研究纳米珍珠粉-DMEM培养液浸提液对L929细胞的影响，结果显示，与阴性对照组相比，浸提液对L929细胞增殖有一定抑制作用，这可能是纳米珍珠粉中碳酸钙颗粒吸附了培养基中的一些有效成份而导致细胞缺乏营养和增殖抑制[10～12]；碳酸钙微溶于水，PH值变化对细胞会有不同程度的影响，此外，培养基中的一些悬浮纳米碳酸钙粒子可以通过氧化损伤细胞[10，12，13]。由于细胞受温度、渗透压、酸碱度、营养成分等多方面因素的影响，确切原因还有待进一步研究。总之，经球磨制备的纳米珍珠粉表现为轻微的细胞毒性，根据GBT/ISO标准仍可认为其为合格材料。

体外溶血试验是将材料或浸提液与红细胞接触，通过测定溶液中的血红蛋白量反映红细胞破坏程度，血红蛋白量升高，反映出红细胞在与材料和器械接触中细胞膜的易破裂性。本研究中0.2g/ml纳米珍珠粉浸提液的溶血率为1.01%，远低于国际标准要求的溶血率小于5%，符合GBT/ISO血液相容性标准，可以认为该材料无毒。

皮内反应试验是通过皮内注射材料浸提液，对材料产生刺激反应的潜在性做出评价。本研究中在将纳米珍珠粉盐水浸提液及对照组盐水分别注射于家兔背部，各观察期皮肤无水肿和红斑，皮内反应指数为0，根据GBT/ISO标准，可以认为试验材料无刺激作用。

急性全身毒性试验是指24h内一次或多次大剂量给予机体后造成机体全身代谢的毒性反应，从而评价材料对生物体的急性毒性作用。本实验是将纳米珍珠粉浸提液按大鼠的最大剂量20ml/kg体积重量比进行腹腔注射，实验组和对照组大鼠都无中毒症状及不良反应，没有发生死亡现象，各观察时间点所有动物体重都有不同程度增加，随着时间延长，不断增加。腹腔探查及内脏组织病理检查无异常，根据GBT/ISO标准，可以认为纳米珍珠粉浸提液体内无急性毒性作用。

通过上述的细胞毒性试验、溶血试验、皮内刺激试验和急性毒性试验的结果，表明实验材料符合国家生物医学实验评价标准。因此，可以认为纳米珍珠粉具有一定的生物相容性，有必要对该材料在动物和人体中的生物学性质进行进一步研究。