白云参多糖含量测定

云南云河药业股份有限公司，云南 个旧 661000

白云参为桔梗科金钱豹属植物大花金钱豹(CampanumoeajavanicaBl. subsp．Javanica) ，又名土党参，主产于云南西部、西南部。本品性甘，平，补中益气、润肺生津。主治病后体虚、肺结核、多汗、虚咳、神经衰弱、食欲不振、久泻、产后乳汁不下[1-3]。该药材是云南省彝药、苗药常用地方中草药之一。多糖是白云参有效成分之一，具有抗衰老、抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能等作用[4-6]，具有较好研究应用价值。但是，目前白云参多糖的测定方法研究较少。多糖的测定方法主要有硫酸蒽酮法、硫酸苯酚法、3，5-二硝基水杨酸法等等[7-10]。笔者采用硫酸-蒽酮法测定白云参多糖，以便为白云参质量标准的提高和药材中多糖的深入研究和综合利用提供一定依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2401PC紫外分光光度计(SHIMADZU)；DZF-6030A型真空干燥箱(上海恒科学仪器有限公司)；MJ-600超声波发生器(无锡市美极超声设备有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩仪市予华仪器有限责任公司)；FA1604电子天平(上海天平仪器厂)。

1.2 试剂和样品 蒽酮(批号：20170420，国药集团化学试剂有限公司)；浓硫酸(批号：20160501，重庆川东化工(集团)有限公司)；D(+)葡萄糖(批号：B21882，上海源叶生物科技有限公司)；白云参(鸿翔中药科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 葡萄糖标准溶液制备 称取105 ℃干燥至恒重的D(+)葡萄糖10.00 mg，用蒸馏水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，混合摇匀，即葡萄糖标准溶液浓度为0.1 mg/mL。

2.2 硫酸-蒽酮溶液(2 g/L)的配制 称取蒽酮0.5 g，用浓硫酸溶解并定容于250 ml容量瓶中，混合均匀。

2.3 样品溶液制备

2.3.1 白云参多糖提取与精制 准确称取干燥的白云参粉末400 g，加80%乙醇3100 mL，超声波提取2次，每次1 h，过滤。药渣中加入3000 mL纯化水，超声波提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15 g/mL的清膏，加乙醇使含醇量为85%，冷藏48 h，过滤，沉淀用纯化水溶解，加0.6%活性炭搅拌30 min，过滤，滤液加乙醇使含醇量为85%，冷藏36 h，过滤，沉淀在60 ℃条件下真空干燥，即得到白云参粗多糖。

2.3.2 白云参多糖溶液的配制 称取10.10 mg白云参粗多糖，加蒸馏水溶解定容至250 mL。

2.4 测定波长 分别精密量取葡萄糖标准使用液、样品溶液各2.0 mL，加8.0 mL硫酸-蒽酮液，在沸水浴中加热15 min，用紫外-可见分光光度计于200～700 nm 波长范围内扫描。对照品和供试样品溶液显色后均在589 nm 处有最大吸收。因此，实验时将589 nm 确定为测定波长。

2.5 硫酸-蒽酮溶液用量试验 分别吸取供试样品溶液 2.0 mL于试管中，分别加入硫酸-蒽酮溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，摇匀，在沸水浴中加热15 min，用自来水冷却至室温，加浓硫酸稀释至14.0 mL，在589 nm处测其吸光度。由图1 可知，随着硫酸-蒽酮溶液量增加，相应的吸光度值也随之增加，当加入量达到8.0 mL 以后，溶液吸光度变化趋势变缓。因此，实验时显色剂硫酸-蒽酮溶液用量选择8.0 mL 。

2.6 加热时间的确定 分别吸取供试样品溶液 2.0 mL 于比色管中，按2.5确定的量加入硫酸-蒽酮溶液，摇匀，在沸水浴中加热10、15、 20、25、30、35 min，用自来水冷却至室温，在589 nm处测其吸光度。由图2可知，随着加热显色时间的增加，白云参多糖溶液吸光度值先增加后减小，在加热时间为15 min时，溶液的吸光度值最大。因此，将实验加热显色时间确定为15 min 。

2.7 标准曲线的绘制 精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL ，分别加蒸馏水至2.0 mL，摇匀。加8.0 mL硫酸-蒽酮液，在沸水浴中加热显色15 min；以 2.0 mL 蒸馏水代替葡萄糖标准溶液，显色后作为空白。分别在589nm处测其吸光度。以葡萄糖质量浓度(C)为横坐标，相应的吸光度(A)为纵坐标，绘制吸光度-葡萄糖质量浓度的关系曲线图，回归方程式为Y=9.8159X+0.037，r=0.9999。实验结果表明，葡萄糖质量浓度在0.0201～0.1005 mg/mL 范围内线性关系良好，标准曲线如图 3 所示。

2.8 方法学考察

2.8.1 精密度试验 分别吸取6份供试样品溶液 2.0 mL，按照标准曲线制备方法测定吸光度。结果，吸光度的平均值是0.257，RSD= 1.21%。实验结果表明该方法的精密度良好。

2.8.2 稳定性试验 精密量取白云参多糖溶液 2.0 mL，按照标准曲线制备方法测定吸光度，在60 min内每间隔10 min测定吸光度，RSD=1.26%。结果表明试样溶液在60 min内稳定。

2.8.3 重复性试验 精密称取同一批次白云参粗多糖10.00mg，共6份，按照所确定条件进行平行实验，在589nm处测定吸光度，计算白云参多糖的含量。实验结果显示，多糖的平均含量是578mg/g，RSD=1.16%，表明该方法重复性良好。

2.8.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的白云参多糖(含量：578 mg/g)6份，每份约5 mg，分别加入葡萄糖标准品溶液30 mL于100 mL容量瓶，按照标准曲线制备方法处理，在589 nm处测定吸光度，计算回收率。结果测得的平均回收率为99.85%，RSD=0.46 %，表明实验方法的系统误差较小，准确度较高。见表1。

表1 加样回收率试验结果

3 讨论

3.1 显色方法选择 硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测多糖原理基本相似，均是多糖在强酸性条件下水解生成单糖，继续脱水成糠醛或者糠醛类衍生物，与相应的显色剂显色。硫酸苯酚法进行稳定试验时，数据变化较大，稳定性稍差；另外苯酚在空气中极易氧化成淡黄色物质，在测定过程中需要避光和迅速操作。因此，本实验选用硫酸蒽酮法作为白云参多糖测定方法。

3.2 对照品选择 在进行测定对照品选择时，分别选用葡萄糖、葡聚糖与硫酸蒽酮溶液显色后，进行全波长范围扫描，两种样品均在589 nm 处有最大吸收。但是，葡聚糖有多种分子量类型产品，其与硫酸蒽酮溶液显色是否存在差异还需要进一步验证。因此，本实验选用葡萄糖作为对照品。

多糖类成分在药用植物中分布广泛，具有多种活性，白云参中含有大量的多糖类成分，但是有关白云参多糖含量测定方法的报道极少。所以，本研究以葡萄糖为对照品，硫酸蒽酮溶液为显色剂，用紫外分光光度法测定白云参多糖含量，并进行方法学考察。实验结果表明，该方法操作简单，结果准确，且重现性好，可在一般实验条件下进行白云参多糖含量测定，符合常规实验要求，为白云参多糖类化合物开发利用提供一定的科学依据。