UPLC-MS/MS检测马兜铃属药材中4种马兜铃酸的含量

上海佰年诗丹德技术有限公司，上海 201203

马兜铃酸(Aristolochic acid，AA)为硝基菲类化合物，主要存在于马兜铃属和细辛属植物中。近年来，文献报道马兜铃酸的肾毒性及致癌作用引起国内外学者的广泛重视[1-8]。2002年，世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构将马兜铃酸列为一种潜在的致癌物质，2012年将其列为Ⅰ类致癌物[3]。2003 年以来，我国药品监管部门先后取消了青木香、关木通、广防己等含马兜铃酸药材的质量标准，并对其他含马兜铃酸的药材如朱砂莲、天仙藤、马兜铃、寻骨风等采取了加强监管、修订说明书或质量标准等措施，以控制其安全性风险。2017年10月18日《Science Translational Medicine》以封面文章的形式刊登了一篇名为“马兜铃酸及其衍生物与台湾及亚洲地区肝癌广泛相关”[9]的文章，提示马兜铃酸与肝癌也有很强的相关性，再次将马兜铃酸推至舆论的风口浪尖。

在我国尚有含马兜铃酸的药物上市销售。对含此类成分的药材进行合理有效的控制是保证人民用药安全的重要手段。本文采用UPLC-MS/MS法对马兜铃、青木香、天仙藤、朱砂莲、寻骨风5种马兜铃属药材中马兜铃酸A、B、C、D的含量进行了测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器 1290 超高效液相-G6460三重串联四极杆质谱联用仪(美国安捷伦科技公司)；离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 材料 马兜铃酸A、B、C、D、金合欢素(纯度98%以上，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；甲醇(HPLC级，美国赛默飞世尔科技公司) ；乙酸(HPLC级，美国西格玛公司)；甲醇(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司)；马兜铃、青木香、天仙藤、朱砂莲、寻骨风购自各药材公司，经我公司刘倩博士鉴定，马兜铃为马兜铃属北马兜铃(AristolochiacontortaBge)的果实，青木香为马兜铃科植物马兜铃(AristolochiadebilisSieb. et Zucc.) 的干燥根，天仙藤为北马兜铃(AristolochiacontortaBge.)的干燥地上部分，朱砂莲为四川朱砂莲 (AristolochiacinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu) 的干燥块根，寻骨风为马兜铃科植物绵毛马兜铃(AristolochiamollissimaHance)的地上部份。水为超纯水。

表1 不同品种药材饮片信息

表1 不同品种药材饮片信息

2 方法与结果

2.1 分析条件 Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相：65%甲醇-0.01%乙酸水溶液；流速：0.40 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。电喷雾离子源(ESI)，检测模式：正离子检测；MRM模式：马兜铃酸A：m/z 359.1→298.1，定性离子对m/z 359.1→324.1；马兜铃酸B：m/z 329.0→268.0，定性离子对m/z 329.0→294.1；马兜铃酸C：m/z 345.2→282.0，定性离子对m/z 345.2→310.0；马兜铃酸D：m/z 375.0→312.0，定性离子对m/z 375.0→296.9；内标金合欢素：m/z 285.0→242.0，定性离子对：m/z 285.0→152.1，干燥气流速：5 L/min；雾化气压力：45 psi；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：11 L/min。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取马兜铃酸A、B、C、D对照品，加甲醇配制成质量浓度分别为0.12、0.11、0.13、0.12 mg/mL的对照品储备液，4 ℃保存，备用。

2.3 内标溶液的制备精密称取金合欢素对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.013 mg/mL的内标溶液，4 ℃保存，备用。

2.4 供试品溶液的制备 精密称取药材1.0 g，加入10 mL70%甲醇溶液，浸润15 min，超声提取30 min，3500 rpm离心10 min，分离上清液，向残渣中加入10 mL70%甲醇溶液，超声提取30 min，3500 rpm离心10 min，合并两次上清液，定容于50 mL容量瓶中。取供试品溶液500 μL，加入内标10 μL，甲醇490 μL，混匀，0.22 μm微孔滤膜过滤。UPLC-MS/MS检测。对照品及样品的MRM模式图见图2。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系 分别精密吸取对照品储备液5、10、20、100、500、1000 μL，加入甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，制得系列混合对照品溶液。取各浓度对照品溶液500 μL，加入内标10 μL，甲醇490 μL，混匀， 0.22 μm微孔滤膜过滤，UPLC-MS/MS检测，分别以马兜铃酸A、B、C、D峰面积与内标峰面积的比值(Y)对各对照品浓度(X)进行线性回归，绘制标准曲线，马兜铃酸A的回归方程为y=1.5803x+0.6644，r= 0.9967，在0.06～12 μg/mL范围内线性关系良好；马兜铃酸B的回归方程为y= 1.4476x+0.1844，r= 0.9980，在0.055～11 μg/mL范围内线性关系良好；马兜铃酸C的回归方程为y= 1.4451x+0.3561，r= 0.9969，在0.065～13 μg/mL范围内线性关系良好；马兜铃酸D的回归方程为y=2.0126x+0.1115，r=0.9982，在0.06～12 μg/mL范围内线性关系良好。按信噪比(S/N)为10计算马兜铃酸A、B、C、D的定量限分别为6×10-5、2.2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4ng，按信噪比(S/N)为3计算马兜铃酸A、B、C、D的检测限分别为1.2×10-4、4.4×10-4、4.2×10-4、4.4×10-4ng。

2.5.2 精密度试验 取马兜铃药材粉末1.0 g，按照2.4 项下方法进行处理，按 2.1 项下条件测定，连续进样测定 6 次，并记录马兜铃酸A、B、C、D的峰面积与内标峰面积的比。结果RSD分别为2.41%、2.07%、2.84%、2.71%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取2. 5. 2项下制备的供试品溶液，在0、1、2、4、8、12、24 h 按照2. 1 项下条件进行测定，记录峰面积，以内标法计算马兜铃酸A、B、C、D的含量。结果其含量的RSD分别为3.77%、4.01%、4.39%、4.85%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 取同一批次马兜铃药材粉末 6份，按照 2.4 项下方法制备供试品溶液，并按 2.1 项下条件测定，计算马兜铃酸A、B、C、D的含量。结果RSD分别为2.67%、4.25%、3.13%、3.98%，表明该方法的重复性良好。

2. 5. 5 加样回收率试验取已知含量样品 (MDL04) 6份，精密称取0.5 g，分别加入一定质量的马兜铃酸A、B、C、D，按照2.4项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件进行测定，计算回收率与RSD。马兜铃酸A、B、C、D的加样回收率分别为89.95%、92.06%、91.06%、92.18%，RSD分别为3.88%、3.97%、4.79%、4.76%。见表2。

2. 6 样品测定取各药材样品适量，粉碎，按照2.4 项下的方法制备供试品溶液，以 2.1 项下条件进行测定，内标法计算中药材中马兜铃酸A、B、C、D的含量，结果见表3。

表2 加样回收率试验结果 (n=6)

表3 五种药材中马兜铃酸A、B、C、D的含量 (n=3,μg·g-1)

续表 表3 五种药材中马兜铃酸A、B、C、D的含量 (n=3,μg·g-1)

注：“-”表示未检测到。

3 讨论

2015版药典[10]中规定，天仙藤中马兜铃酸A的含量不得超过0.01%，细辛中马兜铃酸A的含量不得超过0.001%，马兜铃仅作了薄层鉴别，不能有效控制药材的质量。研究发现，马兜铃酸-DNA加合物(AA-DNA加合物)的形成是马兜铃酸致癌及致突变的重要原因[11-13]，可能也参与了马兜铃酸肾病的发病过程[14]。本研究在对马兜铃、天仙藤、青木香、朱砂莲等来源于马兜铃属的药材进行马兜铃酸-DNA加合物研究时发现，除了被广泛研究的马兜铃酸A、B以外，还有一种马兜铃酸成分也能形成DNA加合物，即马兜铃酸D。在随后进行的Ames波动试验中发现，马兜铃酸A、B均具有致突变作用，且马兜铃酸B的致突变作用强于马兜铃酸A。另外马兜铃酸D也很可能是马兜铃酸中具有遗传毒性的成分[15-16]。马兜铃酸C在该试验中未发现致突变作用。

本研究对马兜铃属5种药材中马兜铃酸A、B、C、D的含量进行测定。结果发现马兜铃、青木香、天仙藤、朱砂莲、寻骨风中均含马兜铃酸A、B、C、D。马兜铃中马兜铃酸A、B、C、D的含量都比较高，其中马兜铃酸A的含量最高；相对于马兜铃酸B、C、D，青木香、寻骨风中马兜铃酸A的含量较高；天仙藤中马兜铃酸D的含量较高，明显高于其他四种药材，朱砂莲中马兜铃酸A、B、C、D的含量均较低。五种药材中马兜铃所含四种马兜铃酸的总量最高。分析Ames波动试验中呈阳性结果的马兜铃酸A、B、D在五种药材中的含量，目前研究较多的马兜铃酸A在青木香中含量最高(最高为146.98 μg/g)，其次为马兜铃，寻骨风，天仙藤、朱砂莲中含量较低；马兜铃酸B在马兜铃、青木香的含量相对较高，但明显低于同一药材中马兜铃酸A的含量； 五种药材中马兜铃酸D含量最高的是天仙藤，最高者达到161.50 μg/g，其次为马兜铃。可见马兜铃酸A、B、D在五种药材中的含量有较大差别，以上结果提示我们仅检测马兜铃酸A的含量是不够的，不能保证临床用药安全。

实验过程中四种马兜铃酸对照品的质谱行为进行了分析。结果发现在正离子模式下，马兜铃酸A一级质谱为m/z 705.1[2M+Na]+，m/z 359.1[M+NH4]+， m/z 364.1[M+Na]+，以及较低的m/z 342.1[M+H]+，产物离子为m/z 298.1[M+H-CO2]+，及m/z 324.1[M+H-H2O]+；马兜铃酸B一级质谱为m/z 645.1[2M+Na]+，m/z 329.1[M+NH4]+，m/z 334[M+Na]+，以及较低的m/z 312.1[M+H]+，产物离子为m/z 267.9[M+H-CO2]+，及m/z 294.1[M+H-H2O]+，与文献报道[17]一致；马兜铃酸C一级质谱为m/z 677.0[2M+Na]+，m/z 345.2[M+NH4]+，以及较低的m/z 328.1[M+H]+，产物离子为m/z 282.0[M+H-CO-H2O]+，m/z 310.0[M+H-H2O]+及m/z 237.1[M+H-H2O—CO-NO2]+；马兜铃酸D一级质谱为m/z 737.1[2M+Na]+，m/z 375.2[M+NH4]+，以及较低的m/z 358.1[M+H]+，产物离子为m/z 312.0[M+H-CO-H2O]+，m/z 296.9[M+H-CH3-NO2]+。

负离子模式下，马兜铃酸A一级质谱为m/z 340.1[M-H]-，m/z 703.0[2M+Na-2H]-，产物离子为m/z 266.0，为[M-H]-脱掉CO2及甲氧基得到的离子；马兜铃酸B一级质谱为m/z 310.2[M-H]-，m/z 643.2[2M+Na-2H]-，产物离子为m/z 265.7[M-H-CO2]-；马兜铃酸C一级质谱为m/z 326.2[M-H]-，m/z 653.2[2M-H]-，产物离子为m/z 235.9[M-H--H2O-CO-NO2]-；马兜铃酸D一级质谱为m/z 356.1[M-H]-，m/z 713.1[2M-H]-，产物离子为m/z 266.1[M-H--H2O-CO-NO2]-,及 m/z 235.9，为m/z 266.1脱掉甲氧基得到的离子。

马兜铃酸A、B、C、D在正负离子模式下均有响应。其中马兜铃酸A、B在正离子模式下响应较高，马兜铃酸C、D在负离子模式下响应相对较高，这是由于在马兜铃酸C、D结构中引入了羟基，使得它们在负离子模式下有更好的响应。由于在检测中对质谱进行正负离子切换会降低灵敏度，且对仪器损耗较大，而马兜铃酸C、D在正离子模式下也有较好的响应，因此选择采用正离子模式检测。

近年来，马兜铃酸类成分的安全性受到广泛关注。李功勋等[18]利用UPLC-QQQ-MS对不同种类药材中马兜铃酸Ⅰ的含量进行了测定，但只测定了一种成分含量，不能有效控制药材质量；路军章等[19]建立HPLC-MS同时检测马兜铃中6种马兜铃酸类成分的方法，质谱采用ESI负离子模式和选择性离子扫描(SIM)，检测时间为60min。检测时间较长，质谱的SIM模式与MRM模式相比，后者灵敏度更高；本文采用超高效液相色谱-串联质谱法，多反应监测模式，正离子检测对五种马兜铃属药材中的马兜铃酸A、B、C、D的含量进行了测定，5分钟内可完成检测。与已有方法相比，本方法快速，灵敏度高，为含马兜铃酸药材的质量控制提供参考。