肝龙胶囊联合水飞蓟素体外抗肝纤维化的实验研究*

邵明园，焦素月，李燕，赖泳

（1.大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671003；2.大理大学 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671003）

肝纤维化是诸如病毒性肝炎、脂肪肝、酒精肝等慢性肝病发展为肝硬化或肝癌的中间环节，特征为细胞外基质（extracellular matrixc, ECM）大量积累及降解失调。多种因素导致肝星状细胞活化，并分泌促纤维化细胞因子，使胶原合成增加是肝纤维化的主要病理过程。目前，常用的抗肝纤维化药物有秋水仙碱、复方甘草酸苷、还原型谷胱甘肽等，但无理想的治疗肝纤维化药物。水飞蓟素是治疗肝损伤的传统药物。研究发现，水飞蓟素能改善实验性肝纤维化的程度，具有肝保护作用[1-3]。肝龙胶囊是抗肝炎的新药，其药用成分主要为美洲大蠊提取物。美洲大蠊提取物能抑制大鼠肝星状细胞的增殖并减少ECM的产生[4-5]。许多研究表明，美洲大蠊提取物具有抗肝纤维化的作用[6-7]。前期研究发现，水飞蓟素单独使用时效果不明显，会有腹泻、消化不良等不良反应。肝龙胶囊单独使用时抗肝纤维化作用不明显。因此，本研究选取肝龙胶囊联合水飞蓟素进行体外实验，以期为肝龙胶囊增强水飞蓟素抗肝纤维化作用，提供药理学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株

人正常肝细胞（human hepatic stellate cell line,L-02）购自中国科学院上海细胞库（HTCC01），人肝星状细胞系（human hepatic stellate cell line, LX-2）购自中南大学细胞库（HTCC-4）。

1.2 药品及试剂

肝龙胶囊（昆明赛诺制药有限公司，批号13032402），水飞蓟素胶囊（天津天士力圣特制药有限公司，批号15041601），Ⅲ型前胶原（procollagen Ⅲ,PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-collagen, Ⅳ-C）、层粘连蛋白（laminnin, LN）、透明质酸（hyaluronic acid, HA）、I型胶原（collagen type I, Col-I）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）酶联免疫检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），胎牛血清（美国Gibco公司，批号1618862），DMEM高糖培养基粉末（美国Gibco公司，批号1710802），Trizol（上海起发实验试剂有限公司，批号 SL24223904），2×Taq PCR MasterMix（上海 Thermo Scientific公司，批号 002222377），DNA Marker D2000（北京天根生化科技有限公司，批号H7104），Biowest琼脂糖（北京基因科技有限公司，批号111760），焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate, DEPC）（北京索莱宝科技有限公司，批号729b028）。

1.3 主要仪器与设备

Synergy HT多功能酶标仪（美国Bio Tek公司），Thermo Scientific Series型二氧化碳CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司），2720型PCR扩增仪（美国ABI公司），G：Box 凝胶成像系统（英国 Syngene公司），DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂），核酸蛋白测定仪（美国BIO-RAD公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 将LX-2细胞从-80℃超低温冰箱中取出复苏，用含10%胎牛血清和1%青链霉素抗生素的DMEM完全培养基进行培养，细胞长至80%～90%时用0.2%胰蛋白酶消化传代，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，选取对数期生长良好细胞用于实验。

1.4.2 细胞给药浓度筛选 选取对数期生长的L-02、LX-2细胞以1×105个/ml的密度种板，按1×104个/孔接种于96孔板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养12 h，使其完全贴壁。将肝龙胶囊（A）和水飞蓟素（C）分别以7.5和3.5 mg/ml的浓度以二倍比向下稀释5个浓度进行交叉给药。采用MTT法测细胞的存活率，选取药物对L-02细胞无明显抑制作用时的浓度作为联用药的最佳浓度。存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（阴性组OD值-空白组OD值）×100%。以该最佳浓度的二倍比浮动2个浓度进行后续实验（见表1）。

表1 肝龙胶囊和水飞蓟素进行交叉给药的浓度

1.4.3 酶联免疫吸附法 细胞给药处理结束后，取上清，2 000 r/min离心20 min。将上清液转移至无菌的96孔板内，按照试剂盒说明书检测Col-I、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA、TGF-β1水平的变化。

1.4.4 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR） 采用 RT-PCR检测细胞内Col-1和TIMP-1 mRNA的表达。①LX-2细胞内总RNA的提取、鉴定和浓度测定。采用Trizol试剂提取细胞中总RNA，取2μl总RNA，用0.1%DEPC稀释20倍，用核酸蛋白测定仪检测纯度和浓度，总RNA纯度以A260/A280 在1.80～2.00为合格，合格后将总RNA置于-20℃冰箱保存备用。②总RNA逆转录。按照逆转录酶说明书进行操作，取1μg模板RNA和1μl Oligo（dt）18引物、10μl DEPC灭菌水置于EP管中离心混匀，65℃孵育5 min，冰浴2 min后离心，置于冰上。依次加入4μl 5×Reaction Buffer、1μl RibolockTMRibonuelease Inhibitor、2μl 10 mmol/L dNTP mix和1μl RevertAidTMM-MuLv逆转录酶。轻弹管壁使其混匀，瞬时离心3 s，将反应体系置于42℃孵育60 min，70℃终止反应5 min，冰上冷却；将合成好的cDNA置于-20℃保存备用。③PCR扩增Col-I、TIMP-1基因和内参β-actin基因。以逆转录合成的cDNA为模板，25μl反应体系内加入8.5μl灭菌超纯水，12.5μl 2×Taq PCR Master Mix，正向引物和反向引物各1μl，2μl PCR产物进行扩增。引物序列和反应条件见表2。④琼脂糖凝胶电泳。取5μl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用Gel-pro 4.0软件对条带进行灰度、面积扫描，以β-actin为内参行半定量分析，其比值用于统计学分析。

表2 PCR引物序列、反应条件及产物大小

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。分析，差异有统计学意义（F=9.023，P=0.000），L-02细胞存活率随着水飞蓟素浓度的降低而逐渐升高。见图1。

2 结果

图1 水飞蓟素单用对L-02细胞存活率的影响 （±s）

2.1 水飞蓟素单用与联合肝龙胶囊对L-02细胞存活率的影响

2.1.1 水飞蓟素单用 MTT结果显示，C3、C4、C5组的L-02细胞存活率分别为（0.48±0.05）%、（0.52±0.11）%和（0.70±0.12）%，经单因素方差

2.1.2 水飞蓟素联合肝龙胶囊 A4C3、A4C4、A4C5、A5C3、A5C4、A5C5、A6C3、A6C4、A6C5 组的 L-02细胞存活率分别为（0.54±0.12）%、（0.67±0.13）%、（0.73±0.20）%、（0.67±0.09）%、（0.76±0.13）%、（0.79±0.15）%、（0.74±0.02）%、（0.82±0.10）%和（0.89±0.32）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=54.369，P=0.024）。进一步两两比较经LSD-t检验，当肝龙胶囊浓度为0.469和0.938 mg/ml时，与不同浓度水飞蓟素联用均可使L-02细胞存活率升高；当肝龙胶囊浓度＜0.938 mg/ml时，与不同浓度水飞蓟素联用均可使L-02细胞存活率先升高再降低，之后又升高。见图2。

图2 水飞蓟素联合肝龙胶囊对L-02细胞存活率的影响（±s）

2.1.3 水飞蓟素单用与联合肝龙胶囊 C3、C4、C5、A4C3、A4C4、A4C5、A5C3、A5C4、A5C5、A6C3、A6C4、A6C5组的L-02细胞存活率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=3.575，P=0.015）。进一步两两比较经LSD-t检验，与单独用药相比，0.469 mg/ml肝龙胶囊联合0.438 mg/ml水飞蓟素对L-02细胞无明显抑制作用。见图1、2。

2.2 肝龙胶囊联合水飞蓟素对LX-2细胞中Col-I、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA、TGF-β1水平的影响

24、48和72 h时，各组LX-2细胞中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、Col-I水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；24和48 h时，各组LX-2细胞中TGF-β1水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；72 h时，各组LX-2细胞中TGF-β1水平比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，肝龙胶囊联合水飞蓟素可使LX-2细胞中TGF-β1、LN、HA、Col-I水平降低，而对PCⅢ存在双向调节的作用，高浓度时抑制，低浓度时促进；肝龙胶囊联合水飞蓟素致LX-2细胞中LN、HA、Col-I、TGF-β1水平降低的作用优于水飞蓟素单用（P＜0.05）；肝龙胶囊联合水飞蓟素与水飞蓟素单用的PCⅢ、Ⅳ-C水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、4。

表3 水飞蓟素单用与联用肝龙胶囊对LX-2细胞LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量的影响 （n =6，ng/ml，±s）

表3 水飞蓟素单用与联用肝龙胶囊对LX-2细胞LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量的影响 （n =6，ng/ml，±s）

注：1）与阴性组比较，P ＜0.05；2）与C3、C4、C5组比较，P ＜0.05

LN HA PCⅢ Ⅳ-C 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h A4C3 19.3±1.31）2）30.9±2.31）2）16.1±0.61）2）0.56±0.11）2）3.26±0.91）2）3.79±0.51） 22.4±2.9 11.1±1.21） 4.8±0.61） 5.1±0.91） 16.0±0.81） 18.6±1.9 A4C4 19.6±3.11）2） 34.8±5.3 35.1±5.1 1.25±0.21）2） 5.52±1.3 5.82±1.52） 28.4±6.5 16.6±3.61） 22.8±5.2 12.3±2.41） 17.9±1.6 19.1±1.9 A4C5 23.3±2.42） 40.8±4.5 31.2±3.21）2）2.94±0.62）6.76±0.82）5.96±0.92） 28.4±2.6 30.6±3.8 18.1±0.6 14.6±1.31） 19.9±1.7 19.8±1.6 A5C3 20.4±2.02）24.8±1.52） 35.8±1.6 1.04±0.21）2）3.97±0.52）3.52±0.42） 17.0±1.9 19.9±1.6 22.0±2.1 3.35±0.31）16.8±1.41） 15.8±1.5 A5C4 26.1±2.1 32.3±3.1 33.6±1.8 1.97±0.32） 4.36±0.2 4.29±0.42） 19.9±0.4 24.9±1.5 21.1±1.4 8.36±0.91） 18.5±0.6 19.5±0.7 A5C5 31.1±3.8 38.1±3.4 39.6±4.6 2.66±0.32）5.52±0.62） 4.7±0.42） 20.7±0.6 12.5±0.7 12.5±0.9 16.8±0.81） 17.3±0.8 17.9±1.2 A6C3 20.5±2.02） 33.2±3.2 38.1±1.8 1.79±1.72）4.36±0.62） 7.02±1.3 7.3±0.61） 17.4±0.2 21.6±2.3 7.32±0.51） 17.7±1.6 15.2±0.4 A6C4 25.3±2.8 34.3±5.2 39.2±4.8 2.49±0.6 4.66±0.9 5.52±1.1 7.9±0.31） 21.6±3.5 20.3±3.4 17.4±0.9 21.5±2.0 16.5±3.0 A6C5 36.5±3.2 36.5±3.6 47.7±4.5 3.67±3.4 7.61±0.9 8.11±0.7 9.9±0.91） 23.2±2.4 27.1±2.1 17.9±0.7 14.5±1.51） 22.1±2.6 C3 23.7±3.1 36.4±4.2 36.4±4.61） 4.99±0.6 7.56±0.9 7.9±0.8 6.5±0.71） 16.6±1.8 20.8±2.3 8.7±1.81） 16.9±0.91）16.9±1.91）C4 27.5±2.5 36.5±6.1 41.4±8.6 4.69±0.9 6.86±2.0 9.22±2.3 7.2±0.81） 20.9±2.8 19.6±3.5 18.5±2.9 17.2±2.71） 16.7±4.0 C5 37.9±3.9 40.9±3.4 49.1±8.9 5.07±1.4 9.01±2.0 9.51±1.8 10.5±2.11） 23.8±1.8 27.7±2.6 19.0±3.5 19.8±2.7 20.6±2.5阴性组 25.1±3.1 35.3±5.3 43.8±1.8 2.51±0.6 5.01±0.9 7.76±1.1 18.7±0.9 17.9±1.3 19.9±3.1 21.32±2.1 20.27±2.0 19.8±1.5 F值 5.096 4.786 13.079 28.808 85.139 74.044 47.510 23.134 9.272 40.401 4.129 3.204 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.006组别

表4 水飞蓟素单用与联合肝龙胶囊对LX-2细胞Col-I、TGF-β1含量的影响 （n =6，±s）

表4 水飞蓟素单用与联合肝龙胶囊对LX-2细胞Col-I、TGF-β1含量的影响 （n =6，±s）

注：1）与阴性组比较，P ＜0.05；2）与C3、C4、C5组比较，P ＜0.05

Col- I /（ng/ml） TGF-β1/（pg/ml）24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h A4C3 14.68±1.61）2） 13.7±2.31）2） 14.6±2.41）2） 960.2±23.12） 1023.6±9.8 1 833.7±132）A4C4 16.7±2.41）2） 12.2±3.11）2） 14.9±3.61）2） 981.9±24 965.2±151） 1 863.6±352）A4C5 19.1±1.31）2） 17.0±1.22） 17.7±21） 867.1±421）2） 941.9±631） 1 789.0±202）A5C3 17.0±2.51）2） 14.4±2.11）2） 17.8±2.61） 991.9±33 883.7±321） 1 965.2±242）A5C4 20.39±0.9 15.7±0.81）2） 19.4±0.61） 930.3±512） 950.2±361） 2 000.2±452）A5C5 23.2±0.9 15.9±0.81）2） 18.9±1.31） 978.5±511） 1 008.5±38 2 028.5±492）A6C3 21.7±1.3 17.1±0.61） 19.4±0.81） 1 046.8±46 991.9±34 2 106.7±432）A6C4 23.5±0.2 20.3±0.11） 21.5±1.11） 995.2±32 888.7±241） 2 193.2±43 A6C5 27.5±16 20.7±2.01） 20.9±1.41） 1 088.4±34 1 349.7±46 2 576.2±52 C3 24.9±3.4 20.3±2.9 22.6±3.41） 1 058.8±35 1 003.9±421） 2 118.7±48 C4 25.7±6.2 22.5±4.3 23.7±3.81） 1 022.2±61 1 045.5±33 2 220.2±39 C5 28.9±6.2 22.1±5.3 22.3±4.01） 1 092.1±36 1 383.7±26 2 610.2±41阴性组 23.9±2.5 37.2±3.4 46.3±1.6 951.9±41 1 288.1±26 1 835.7±58 F值 12.169 103.908 71.549 174.676 2415.158 1.355 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.249组别

2.3 Col-I、TIMP-1、β-actin基因扩增的PCR产物

对Col-I、TIMP-1、β-actin基因进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3。

2.4 水飞蓟素单用与联用肝龙胶囊对LX-2细胞中Col-I和TIMP-1 mRNA表达的影响

24、48和72 h时，各组LX-2细胞中Col-I和TIMP-1 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，水飞蓟素在单独用药情况下随着浓度的升高，对Col-I mRNA表达的抑制作用逐渐增强。水飞蓟素对TIMP-1 mRNA的影响存在浓度依赖性和时间依赖性。水飞蓟素与A5组联合作用24 h时的Col-I mRNA表达水平与阴性组比较无抑制作用，但在72 h效果较好。水飞蓟素与肝龙胶囊联合使用时，在较高浓度的情况下对Col-I mRNA的抑制作用也是远期效果较好，且优于单药使用；较低浓度的联合对Col-I mRNA无抑制作用；当肝龙胶囊浓度不变时，只有与低浓度的水飞蓟素联合对TIMP-1 mRNA的影响在24 h时不如单独用药，其他浓度组合均优于单独用药，且以远期效果最佳（P＜0.05）。见表5。

表5 水飞蓟素单用与联用肝龙胶囊对LX-2细胞Col-I和TIMP-1 mRNA表达的影响 （n =6，±s）

表5 水飞蓟素单用与联用肝龙胶囊对LX-2细胞Col-I和TIMP-1 mRNA表达的影响 （n =6，±s）

注：1）与阴性组比较，P ＜0.05；2）与C3、C4、C5组比较，P ＜0.05

Col-I mRNA TIMP-1 mRNA 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h A4C3 0.54±0.12 0.42±0.111） 0.26±0.051） 0.23±0.021）2） 0.22±0.031） 0.18±0.051）A4C4 0.61±0.21 0.39±0.141）2） 0.26±0.071）2） 0.29±0.061）2） 0.27±0.041） 0.19±0.041）A4C5 0.55±0.16 0.35±0.071）2） 0.29±0.021）2） 0.44±0.11 0.23±0.021） 0.17±0.021）2）A5C3 0.87±0.25 0.67±0.17 0.24±0.051）2） 0.25±0.031）2） 0.13±0.021）2） 0.19±0.051）A5C4 0.84±0.22 0.70±0.18 0.24±0.031）2） 0.39±0.07 0.37±0.09 0.21±0.051）A5C5 0.83±0.17 0.49±0.16 0.40±0.082） 0.36±0.04 0.30±0.031） 0.17±0.031）A6C3 0.55±0.06 0.57±0.09 0.56±0.10 0.27±0.021）2） 0.27±0.061） 0.15±0.051）A6C4 0.66±0.11 0.76±0.21 1.19±0.32 0.39±0.1 0.21±0.071）2） 0.28±0.071）A6C5 0.63±0.14 0.66±0.13 0.64±0.18 0.60±0.17 0.35±0.08 0.38±0.09 C3 0.64±0.14 0.54±0.1 0.39±0.021） 0.29±0.081） 0.23±0.05 0.17±0.071）C4 0.74±0.13 0.57±0.1 0.42±0.081） 0.39±0.09 0.34±0.06 0.28±0.07 C5 0.72±0.08 0.76±0.05 0.80±0.29 0.33±0.04 0.29±0.08 0.29±0.02阴性组 0.71±0.20 0.73±0.15 0.69±0.09 0.51±0.13 0.54±0.12 0.52±0.08 F值 135.564 286.062 1281.955 434.306 480.806 869.578 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别

3 讨论

慢性肝病严重威胁着人们的生活健康，全世界＞10 000万人是乙型肝炎病毒的感染者。慢性肝病将发展为肝纤维化，肝纤维化是肝脏持续受损后的一种愈合反应，表现为ECM合成与降解失衡，减少ECM的产生可以阻止肝纤维化的发展[8]。肝纤维化时，ECM大量合成，其中Col-I是最主要的胶原成分，而TIMP-1是抑制Col-I降解的主要酶。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs） 与 TIMPs调 节ECM的合成和降解，TIMPs可抑制MMPs的表达,使ECM降解减少[9]。目前，诊断肝纤维化程度的金标准为肝组织活检，但该标准存在许多缺陷，因此PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA 4项指标在临床上具有重要的意义[10]。TGF-β1在肝纤维化过程中起最关键的作用。这6项指标在肝纤维化过程中大量生成，因此监测药物对肝脏纤维化4项指标和Col-I、TGF-β1水平的影响，即可大致对肝纤维化做出疗效观察或预后判断。

水飞蓟素和肝龙胶囊都是抗肝纤维化的药物。水飞蓟素是一种天然多酚类黄酮化合物，是从药用植物水飞蓟或奶蓟果实中提取的有效成分，由水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟丁组成，是重要的保肝药。水飞蓟素具有强大的抗氧化、抗肝细胞凋亡、抗炎[11]、抗肿瘤[12]、肝细胞保护作用[2]。研究发现，水飞蓟素还具有抗肝纤维化作用，能降低慢性乙肝患者血清中LN、HA、Ⅳ-C的含量，具有较好的抗肝纤维化疗效[13]。肝龙胶囊是治疗慢性乙型肝炎的中药，对大鼠酒精性肝损伤具有防治作用[14]。夏超等[15]研究表明，肝龙胶囊主要的药用成分美洲大蠊提取物能降低血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C的水平，下调肝组织中肌动蛋白和TGF-β1蛋白的表达，同时能减轻肝脏损伤程度。

本研究结果发现，肝龙胶囊联合水飞蓟素可使LX-2细胞中LN、HA、Col-I水平降低，从而减少蛋白聚糖多聚体、胶原蛋白、基底膜等生成。但肝龙胶囊联合水飞蓟素对PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1在高浓度联合条件下抑制效果较好，且在24 h时有抑制作用，随着时间的延长，又呈现增长的趋势，这可能是由于随着时间的延长，使已分泌的TGF-β1、Ⅳ-C等因子进一步活化LX-2细胞，令其活化扩大化，而生成更多的TGF-β1、Ⅳ-C等因子。

另外，在较高浓度情况下，肝龙胶囊联合水飞蓟素对Col-I mRNA抑制作用的远期效果优于单药使用，但较低浓度的联合作用不佳；对TIMP-1 mRNA的影响均优于单独用药；两者联合作用于TIMP-1 mRNA时效果优于单独用药，且呈现时间依赖性。肝龙胶囊联合水飞蓟素可以有效地提高MMPs的活性，下调TIMP-1的表达，加速ECM的降解，从而逆转肝纤维化。TGF-β1是肝星状细胞激活的主要因子，可通过抑制MMPs产生和促进TIMPs合成，使ECM增加。在本实验中，肝龙胶囊联合水飞蓟素较水飞蓟素单用减少TGF-β1的产生，抑制TIMP-1 mRNA的表达，使ECM降解。因此，肝龙胶囊联合水飞蓟素抗肝纤维化的作用优于水飞蓟素单独使用，肝龙胶囊起到协同增效的作用。

本实验尚存在许多不足，所用细胞为人源细胞，与原代细胞存在较大差异，体内外影响因素较大，因此下一步研究可以从体内实验、原代细胞实验方面进行。肝龙胶囊联合水飞蓟素抗肝纤维化作用的机制也不明确，需要进一步研究。