Abraxne对Lewis肺癌小鼠Per2基因及SIRT1因子表达的影响

赵雪峰，范娟，杨玲麟，傅少志，陈琼英

（1.西南医科大学附属医院 肿瘤科，四川 泸州 646099；2.四川省自贡市第三人民医院 放射科，四川 自贡 643020）

肺癌是发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，大部分患者确诊时已为中、晚期，放化疗联合靶向药物治疗成为主要治疗手段[1-3]。Periods基因是近日节律调节系统的核心基因，沉默信息调节因子1（silent information regulator 1, SIRT1）是联系昼夜节律和能量代谢的能量传感器[4-5]。白蛋白结合型紫杉醇（albumin-bound paclitaxel, Abraxne）能加快紫杉醇进入肿瘤细胞，避免合成溶剂可能造成的毒副作用[6]。本研究探究Abraxne对Lewis肺癌小鼠生物钟基因Per2、SIRT1表达的影响，以期为临床治疗肺癌提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

1.1.1 实验动物 6～8周龄清洁级C57BL/6雌性小鼠60只，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂及材料 小鼠Lewis肺癌细胞（lewis lung cancer cells, LLC）由本实验室保存。Abraxne注射用混悬液，规格：5 ml：100 mg/瓶，购自美国Celgene公司，紫素（溶剂型紫杉醇注射液）规格：5 ml：30 mg。购自北京协和药厂。Trizol RAN提取试剂（美国Invitrogen公司），RNA逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，组织蛋白提取试剂（南京凯基生物科技发展公司），兔抗鼠Per2一抗、兔抗鼠SIRT1一抗、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG溶液购自美国Sigma公司。

1.2 动物模型的复制

取本实验室冻存的LLC细胞进行复苏，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中常规培养、传代，传代期间采用MTT法检测细胞活力，确认细胞活力正常且传代3次后即可使用。取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，倒掉培养基，用生理盐水将细胞浓度稀释至5×106个/L。在C57BL/6小鼠右腋部背侧皮下接种0.2 ml LLC细胞悬液（约1×106个细胞），接种后观察小鼠腋下变化，第2～5天皮下可触摸到肿瘤结节。若腋下肿瘤长势良好，在接种5 d后体积可＞100 mm3，则提示Lewis肺癌小鼠模型复制成功。

1.3 实验分组

将接种后的45只Lewis肺癌小鼠随机分为模型组、紫素组和Abraxne组，用剪耳法标记，各15只，其余15只小鼠不做任何处理作为正常对照组。接种后第5天开始给药，连续治疗10 d。将瓶装Abraxne和紫素用生理盐水稀释为3 g/L，配好的溶液应在8 h内使用。Abraxne组从尾静脉缓慢注入Abraxne 30 mg/（kg·d）；紫素组从尾静脉缓慢注入紫素 30 mg/（kg·d）；模型组尾静脉注入等量生理盐水。

1.4 小鼠生存状态观察

接种后第5天起，各组小鼠每天同一时间称重，观察小鼠活动、饮食状态和死亡情况，并做好记录。

1.5 肿瘤体积动态变化

接种后第5天起，每天同一时间用游标卡尺（精确到0.1 mm）测定肿瘤最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（V）：V=ab2/2。统计各组小鼠肿瘤平均体积，绘制肿瘤生长曲线。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应

接种后第15天将小鼠断头处死，完整剥离肿瘤结节组织于液氮中冻存。采用Trizol法提取各组小鼠肿瘤组织的总RNA，并通过逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，采用SYBR荧光定量检测试剂盒对肿瘤组织中的Per2和SIRT1 mRNA进行相对定量分析。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，采用美国ABI公司的7500系统进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，72℃退火15 s，共40个循环。最终以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot检测

取每组小鼠肿瘤组织充分研磨，用组织蛋白提取试剂常规提取蛋白。每组取4μl蛋白样品，用BCA法进行蛋白定量，调节好蛋白浓度。将蛋白样品与等体积2×SDS缓冲液混合后加热变性，通过SDSPAGE电泳分离上清液，把分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上。将膜洗涤后在5%牛血清蛋白溶液中室温封闭1 h，洗涤后将膜置于一抗稀释液（兔抗鼠Per2或SIRT1一抗溶液1∶100）中，4℃孵育过夜。次日早晨将膜快速清洗后，转移到二抗稀释液（碱磷酶标记山羊抗兔IgG溶液1∶1 000）中，室温孵育2 h，清洗后用新配制的显色液进行显色，待出现清晰的条带后终止反应，最后使用GIS-2020数码图像分析系统扫描并分析蛋白杂交条带。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况

模型组接种后第10天1只小鼠死亡。紫素组给药后第6天1只小鼠死亡，给药后第9天2只小鼠死亡。Abraxne组小鼠给药后无小鼠死亡。模型组、紫素组小鼠整体生长情况较差，活动、进食状态不佳，紫素组小鼠较模型组、Abraxne组明显消瘦；Abraxne组小鼠生长情况强于模型组、紫素组，状态最佳。

2.2 Abraxne对Lewis肺癌小鼠体重的影响

正常对照组、模型组、紫素组、Abraxne组小鼠在接种LLC细胞前、接种后第5天、给药后第5和10天的体重变化比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点体重有差别（F=17.703，P=0.000）；②4组大鼠体重有差别（F=7.976，P=0.000）；③4组大鼠体重变化趋势有差别（F=21.641，P=0.000）。见表 2。

表2 Abraxne对Lewis肺癌小鼠体重的影响 （g，±s）

表2 Abraxne对Lewis肺癌小鼠体重的影响 （g，±s）

注：1）与正常对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05；3）与紫素组比较，P ＜0.05。

组别 接种前 接种后第5 d 给药后第5 d 给药后第10 d正常对照组（n =15） 18.62±1.25 18.94±1.38 19.10±1.45 19.13±1.27模型组（n =14） 18.53±1.34 18.25±1.42 18.02±1.281） 17.75±1.031）紫素组（n =12） 18.64±1.29 18.31±1.08 17.74±0.961） 17.08±0.681）2）Abraxne组（n =15） 18.57±1.17 18.28±1.02 18.23±0.98 18.19±0.951）3）F值 0.021 1.043 3.389 9.688 P值 0.996 0.382 0.025 0.000

2.3 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积的影响

模型组、紫素组、Abraxne组Lewis肺癌小鼠给予 Abraxne治疗后第 0、2、4、6、8和 10天的肿瘤体积比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的肿瘤体积有差别（F=35.128，P=0.000）；②3组小鼠肿瘤体积有差别（F=8.376，P=0.000）；③3组小鼠肿瘤体积变化趋势有差别（F=43.624，P=0.000）。见表 3和图 1。

表3 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积的影响 （mm3，±s）

表3 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积的影响 （mm3，±s）

注：1）与模型组比较，P ＜0.05；2）与紫素组比较，P ＜0.05。

组别 第0 d 第2 d 第4 d 第6 d 第8 d 第10 d模型组（n =14） 103.12±8.13 108.15±9.12 120.26±9.25 133.25±10.15 143.76±10.36 149.23±11.39紫素组（n =12） 102.33±8.22 106.26±8.02 114.33±9.271） 123.12±9.251） 127.29±9.171） 131.15±9.381）Abraxne 组（n =15） 103.25±7.12 105.43±8.16 107.56±8.291）2） 112.35±9.051）2） 115.65±8.921）2） 117.12±9.351）2）

图1 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积的影响 （±s）

2.4 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1 mRNA表达的影响

模型组、紫素组、Abraxne组小鼠给药后肿瘤组织中Per2 mRNA相对表达量分别为（0.20±0.02）、（0.31±0.04）和（0.42±0.16），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=17.475，P=0.000）。模型组、紫素组、Abraxne组SIRT1 mRNA相对表达量分别为（0.14±0.04）、（0.23±0.05）和（0.30±0.08），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=25.603，P=0.000）。见图2。

图2 Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1 mRNA表达水平比较 （±s）

2.5 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白表达的影响

模型组、紫素组、Abraxne组小鼠给药后肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，与模型组比较，紫素组、Abraxne组小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见表 4和图 3。

表4 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白表达的影响 （±s）

表4 Abraxne对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白表达的影响 （±s）

注：1）与模型组比较，P ＜0.05；2）与紫素组比较，P ＜0.05。

组别 Per2蛋白 SIRT1蛋白模型组 0.126±0.012 0.134±0.015紫素组 0.182±0.0171） 0.193±0.0181）Abraxne 组 0.257±0.0241）2） 0.232±0.0211）2）F值 181.732 105.299 P值 0.000 0.000

图3 Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白的表达

3 讨论

随着人口老龄化步伐加快和环境污染不断加剧，中国肺癌的发病率、死亡率高居不下。尽管肺癌的治疗手段不断进步，但是中、晚期肺癌的术后5年生存率仅为20%。肺癌的发生是一个多基因调控的复杂过程，致癌基因激活、抑癌基因失活或缺失与肿瘤的形成关系密切[7-9]。因此，深入挖掘肿瘤发生机制为肺癌患者的根治性治疗带来了希望。

紫杉醇是一种从红豆杉树皮中获得的广谱抗癌药物，其作用机制为抑制微管解聚，但其难溶于水，其制药溶媒为聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇混合物，然而该溶媒在体内降解生成的组胺可引起严重过敏反应，限制了溶剂型紫杉醇，如紫素，在临床上的应用[10-11]。Abraxne是把人血白蛋白和紫杉醇通过高压振动技术制成纳米微粒粉剂，使用时加入生理盐水溶解成120～150 nm大小的纳米粒Abraxne混悬液，即可静脉滴注。Abraxne不含助溶剂，可有效提高紫杉醇剂量，且临床用药时不必预防过敏反应[12]。白蛋白是人体内自然存在的疏水性载体，可与一些物质，如脂肪酸、脂溶性维生素、性激素等，通过可逆性共价方式结合[13-14]。白蛋白与内皮细胞膜受体gp60结合后，可激活小窝蛋白-1。小窝蛋白-1为膜表面糖基蛋白，直接协助药物跨膜运输。白蛋白药物复合体依次经过血管内皮细胞、组织、组织间隙，最终蓄积在肿瘤细胞内。此外，肿瘤组织分泌的富含半胱氨酸酸性分泌蛋白，其作用类似于白蛋白受体，可特异吸附白蛋白，因此白蛋白药物复合体可在肿瘤细胞周围聚集，提高局部药物浓度，增强抑瘤能力[15-17]。本研究通过Lewis肺癌模型小鼠实验发现，紫素干预后小鼠整体生长情况较差，活动、进食状态不佳，较模型组、Abraxne组明显消瘦，肿瘤生长速度较模型组减缓，但仍快于Abraxne组。同时通过对小鼠体重进行分析显示，各组小鼠在接种LLC细胞前、接种后第5天、给药后第5和10天均随着时间变化而变化。给予Abraxne治疗后第0、2、4、6、8和10天各组小鼠肿瘤体积大小也随着时间变化而变化。说明紫素能够抑制肿瘤生长，但易产生毒副作用。Abraxne组小鼠给药后无死亡，生长状况明显强于模型组和紫素组，Abraxne干预后肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤生长速度明显小于模型组和紫素组，说明Abraxne较紫素更能抑制肿瘤生长，且不会产生毒副作用，临床使用更加安全。

生物钟是机体自我产生、不受外界因素控制的时间节律性，与衰老、代谢紊乱、肿瘤形成等现象息息相关。生物节律是生物钟的外在体现，包括亚日节律、近日节律、超日节律等。生物体通过近日节律调控肿瘤相关基因表达，生物钟基因异常表达可能会造成近日节律失调，导致肿瘤形成的风险上升。生物钟基因主要包括Periods（Per1-3）、Crystals（Cry1-2）、Bmal1、Clock、Ck1和Timeless[18-19]。Per2基因是近日节律系统的重要成员，参与多个信号通路，调节细胞周期及新陈代谢。研究发现，乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌及肺癌组织中Per2蛋白普遍异常或缺失，Per2基因在癌旁组织中的表达水平明显强于肿瘤组织[20-22]。淋巴瘤和白血病组织中Per2蛋白表达水平明显低于正常组织，诱导Per2高度表达后，肿瘤细胞呈现出细胞周期停滞、增殖能力降低、凋亡速度加快等情况，这些结果暗示Per2在抑制肿瘤生长方面扮演重要角色。哺乳动物SIRT1基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白3脱乙酰酶，与酵母染色质沉默因子2最为同源，具有调节生物体新陈代谢、控制寿命长短等功能。SIRT1能通过去乙酰化与Per2发生作用，SIRT1被激活后，可使Per2去乙酰化，去乙酰化的Per2可被磷酸化后降解，如此周而复始[23-25]。研究发现，SIRT1在肿瘤形成过程中兼具致癌和抑癌基因的功能，其作用关键在于维持致癌和抑癌基因的平衡关系[26-27]。本研究中qRT-PCR和Western blot检测结果显示，紫素组、Abraxne组Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2、SIRT1 mRNA和蛋白表达水平较模型组升高；Abraxne组Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Per2、SIRT1 mRNA和蛋白表达水平较紫素组更高，推测紫杉醇抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的作用机制可能与生物钟基因Per2、SIRT1表达被激活有关，且Abraxne较紫素更能促进肿瘤组织中Per2和SIRT1蛋白的表达，Abraxne在临床上治疗肺癌的效果可能会更好。本研究的不足之处在于未阐明Per2基因的具体抑癌机制，在后续的研究中将对此进一步深入探究。

综上所述，本研究通过右腋部背侧皮下接种LLC复制Lewis肺癌小鼠模型，Abraxne干预后小鼠生长状况明显优于紫素组，肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤组织中Per2、SIRT1 mRNA和蛋白表达水平较模型组、紫素组升高，说明Abraxne治疗肺癌的效果更好、更安全，其作用机制可能与生物钟基因Per2、SIRT1表达被强化有关。然而，肺癌发生、发展的相关因素很多，相关机制复杂，临床治疗肺癌的相关作用机制还需继续深入探究。