丙泊酚对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响

胡微澜，韩威利，杜增利

（1.河南省新乡市中心医院，河南 新乡 453000；2.河南省焦作煤业集团中央医院，河南 焦作 454150）

胃癌作为常见的消化道恶性肿瘤，具有恶性程度高、易转移、易复发、预后较差等特点[1]，目前，手术切除是胃癌最主要的治疗手段[2]，但术后易出现复发、转移而影响患者预后[3]。丙泊酚作为常用的全身麻醉类药物，具有麻醉诱导快，苏醒迅速等优点，是胃癌根除术的常用麻醉药物[4]。有研究指出，丙泊酚在抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡中发挥重要作用[5]。亦有研究指出，丙泊酚可抑制大鼠胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力[6]。本研究通过复制裸鼠人胃癌细胞皮下瘤模型，观察丙泊酚对胃癌裸鼠移植瘤生长的影响，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人胃癌细胞株SGC7901（中科院上海细胞生物化学研究所），30只清洁级级雌性BALB/c裸鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）[动物合格证号：SCXK（沪）2012-00002]，4～5周龄，体重17～21 g，丙泊酚注射液（四川国瑞药业有限责任公司）（批准文号：国药准字H20040079），10%胎牛血清、胰酶、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，总RNA提取试剂盒（Trizol法）（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），扩增试剂盒（美国Axygen公司），核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）、NAD（P）H醌氧化还原酶1[NAD（P）H-quinine oxidoreductase 1, NQO1]、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）、B淋巴细胞瘤（B-cell lymphoma-2c, Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein, Bax）及内参引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，兔抗鼠Nrf2多克隆抗体、兔抗人HO-1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗小鼠NQO1多克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体（上海沪峰化工公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗体（武汉博士德生物公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（美国ABI公司），凝胶电泳成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人胃癌细胞株SGC7901置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在37℃、5%二氧化碳CO2恒温培养箱中培养。胰酶消化后，每2、3 d传代1次，取对数生长期细胞完成后续实验。

1.2.2 复制裸鼠移植瘤模型及分组 取对数生长期细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/ml，用1 ml注射器将500μl细胞悬液注射于裸鼠右前肢皮下，之后放回笼中继续进行饲养。2周后皮下出现5 mm大小的结节为模型复制成功，30只裸鼠模型均复制成功。将裸鼠随机分为对照组、生理盐水组和丙泊酚组，每组10只。对照组未做任何处理；生理盐水组腹腔注射生理盐水1.5 ml/kg，1次/d，连续2周。丙泊酚组腹腔注射丙泊酚20 mg/kg，1次/d，连续2周。

1.2.3 观察指标 观察各组裸鼠给药前后身体变化，饮食、进水及消瘦程度等一般情况，以及腹水、淋巴结肿大、消瘦等恶病质发生情况。

1.2.4 移植瘤体积变化 给药后每3 d用游标卡尺测量移植瘤长径和短径，计算移植瘤体积，移植瘤体积（mm3）=1/2×长径×短径2。第15天时将裸鼠脱臼处死，剥离瘤体，测量移植瘤体积，用电子天平称重，计算抑瘤率，抑瘤率=（对照组移植瘤平均体质量-生理盐水组或丙泊酚组移植瘤平均体质量）/对照组移植瘤平均体质量×100%[7]。

1.2.5 qRT-PCR 采用qRT-PCR检测各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因的表达。取各组裸鼠移植瘤组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂解，用总RNA提取试剂盒提取组织中总RNA，采用紫外分光光度法检测总RNA的纯度并定量。用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为模板链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。引物序列：Nrf2正向引物：5’-ACACGGTCCACAGCTCATC-3’，反向引物：5’-TGTCAATCAAATCCATGTCCTG-3’；NQO1正向引物：5’-CAGAAATGACATCACAGGTGAGC-3’，反向引物：5’-CTAAGACCTGGAAGCCACAGAAA-3’；HO-1正向引物：5’- GCTCGAATGAACACTCTG GAGAT-3’，反向引物：5’-TCCAGAGAGAAAGGAA ACACAGG-3’；Bcl-2 正向引物：5’-CACAAGAGGCCA AGGCTACCT-3’，反向引物：5’-CAGGAAAGCAGG AAGTCTCAA-3’；Bax正向引物：5’-ATTGAGAAA CGATTTGCCTACA-3’，反向引物 ：5’-GGGAAAT GGCTTATTCTCCTTTGCTT-3’；β-actin正向引物：5’-TTGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3’，反向引物：5’-AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3’。PCR 反应条件：94℃预变性1 min，92℃变性30 s，58℃退火30 s，73℃延伸30 s，共36个循环，每个样品设置3个平行反应复孔。用2-△△Ct法计算裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因相对表达量[8]。

1.2.6 Western blot检测 采用Western blot检测各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量。取各组裸鼠移植瘤组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂解，用总蛋白提取试剂盒提取组织中总蛋白，用BCA总蛋白检测试剂盒检查总蛋白浓度。取30μg总蛋白，100℃变性后，进行电泳分离，电转移至聚偏氟乙烯膜，室温下用脱脂奶粉封闭60 min。分别加入一抗兔抗鼠Nrf2多克隆抗体、兔抗小鼠NQO1多克隆抗体、兔抗人HO-1多克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体及兔抗大鼠Bax多克隆抗体（稀释比例分别为1∶1 000、1∶800、1∶1200、1∶500和1∶1 000），室温下孵育120 min，4℃过夜孵育，加入二抗，室温孵育60 min，加入ECL发光试剂后避光反应25min，拍照。采用Image-Pro Plus图像分析软件分析条带灰度值，获得各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量[9]。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用重复测量设计的方差分析或单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；不符合正态分布则采用秩和检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸鼠一般情况

给药后15 d，与丙泊酚组相比，对照组和生理盐水组裸鼠出现进水、饮食量显著减少，体形消瘦明显；对照组、生理盐水组分别有4和3只裸鼠出现浅表淋巴结肿大，且移植瘤周围出现大小不等的卫星癌灶。与给药前相比，丙泊酚组裸鼠进水正常，饮食量略有减少，体重稍减轻，未发生腹水或淋巴结肿大，移植瘤周围未见卫星癌灶。

2.2 各组裸鼠不同时间点移植瘤体积比较

丙泊酚组、对照组、生理盐水组裸鼠给药前，以及给药后3、6、9、12和15 d时的移植瘤体积比较，采用重复测量设计方差分析，结果：①不同时间点的移植瘤体积有差异（F=34.357，P=0.000）；②3组裸鼠移植瘤体积有差异（F=86.172，P=0.000），丙泊酚组的移植瘤体积小于对照组和生理盐水组（P＜0.05）；③3组裸鼠移植瘤体积变化趋势有差异（F=18.394，P=0.000）。见表 1。

2.3 各组裸鼠移植瘤体质量和抑瘤率比较

丙泊酚组、对照组、生理盐水组裸鼠移植瘤体质量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，丙泊酚组裸鼠移植瘤体质量低于对照组和生理盐水组（P＜0.05）。丙泊酚组、对照组、生理盐水组抑瘤率比较，经秩和检验，差异有统计学意义（P＜0.05），丙泊酚组抑瘤率高于对照组。见表2。

表1 3组裸鼠各时间点移植瘤体积比较 （n =10，mm3，±s）

表1 3组裸鼠各时间点移植瘤体积比较 （n =10，mm3，±s）

注：†与对照组、与生理盐水组比较，P ＜0.05

组别 给药前 给药后3 d 给药后6 d 给药后9 d 给药后12 d 给药后15 d对照组 54.2±14.8 143.4±35.0 282.4±57.3 439.6±65.9 621.8±70.2 863.5±78.3生理盐水组 53.9±13.4 145.3±30.6 274.1±54.8 421.2±66.3 614.7±65.4 871.4±88.5丙泊酚组 54.8±15.3 98.3±23.7† 224.2±41.1† 351.6±55.1† 406.5±59.8† 512.6±70.8†

表2 各组裸鼠移植瘤体质量和抑瘤率比较 （n =10）

2.4 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因表达水平比较

丙泊酚组、对照组、生理盐水组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2 mRNA相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，丙泊酚组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2 mRNA相对表达量低于对照组和生理盐水组（P＜0.05），而Bax mRNA相对表达量高于对照组和生理盐水组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表达水平比较 （n =10，±s）

表3 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表达水平比较 （n =10，±s）

注：†与对照组、生理盐水组比较，P ＜0.05

组别 Nrf2 mRNA NQO1 mRNA HO-1 mRNA Bcl-2 mRNA Bax mRNA对照组 1.92±0.13 1.58±0.12 1.69±0.13 1.84±0.17 1.14±0.16生理盐水组 1.90±0.11 1.56±0.10 1.72±0.15 1.83±0.16 1.16±0.18丙泊酚组 1.28±0.14† 1.10±0.08† 1.17±0.10† 1.21±0.13† 1.75±0.14†F值 114.785 69.730 68.887 53.821 45.213 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

丙泊酚组、对照组、生理盐水组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，丙泊酚组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组和生理盐水组（P＜0.05），而Bax蛋白相对表达量高于对照组和生理盐水组（P＜0.05）。见表4和附图。

表4 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较 （n =10，±s）

表4 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较 （n =10，±s）

注：†与对照组、生理盐水组比较，P ＜0.05

组别 Nrf2蛋白 NQO1蛋白 HO-1蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白对照组 0.83±0.09 0.65±0.12 0.75±0.14 0.78±0.08 0.35±0.10生理盐水组 0.84±0.11 0.67±0.14 0.76±0.12 0.80±0.11 0.34±0.09丙泊酚组 0.49±0.13† 0.29±0.08† 0.38±0.07† 0.42±0.13† 0.68±0.13†F值 30.585 23.466 58.075 42.889 15.610 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

附图 各组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白的表达

3 讨论

胃癌细胞具有较强的增殖、迁移及侵袭能力，这是导致胃癌进展迅速、预后不良的重要原因[10]。有效抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，对提高疗效、改善预后具有重要意义。胃癌细胞增殖、迁移、侵袭过程是多基因、多步骤共同作用的结果，其具体作用机制尚未完全清楚。

丙泊酚是临床上常用的麻醉类药物，具有良好的麻醉诱导和维持效果，常用于肿瘤根治性手术[11]。近年来研究发现，丙泊酚具有一定的抗肿瘤作用[12]。白建杰等[13]指出，丙泊酚可下调人乳腺癌MDAMB-231细胞中H19的表达而抑制细胞迁移、侵袭过程。赖晓红等[14]亦采用离体细胞实验表明，丙泊酚可通过抑制RhoA/ROCK1信号通路，降低人胃癌细胞的转移能力。张健[15]指出，丙泊酚可诱导肝癌细胞凋亡。本研究利用人胃癌细胞株SGC7901复制裸鼠胃癌移植瘤，结果显示，丙泊酚组裸鼠给药后3、6、9、12和15 d时移植瘤体积均低于对照组和生理盐水组，说明丙泊酚可抑制裸鼠移植瘤生长；15 d时将3组裸鼠处死，对移植瘤进行称重，结果丙泊酚组裸鼠移植瘤体质量降低，而抑瘤率升高，说明丙泊酚具有抗胃癌移植瘤生长的作用，在抑制胃癌移植瘤生长中发挥重要作用。

Nrf2作为一种重要的转录因子，是细胞氧化应激反应中的关键性因子，在调控氧化还原平衡、细胞代谢、增殖及凋亡过程中发挥重要作用。研究发现，Nrf2可与抗氧化反应元件（antioxidant response element, ARE）结合，启动多种解毒酶、抗氧化基因的表达，如HO-1、NQO1等，保护细胞免于受损[17]。也有研究表明，Nrf2/ARE通路参与多种肿瘤的生长、转移过程，是重要的抗肿瘤治疗靶位[18]。有研究指出，下调Nrf2和下游靶基因的表达可抑制肺癌A549细胞的增殖和转移[19]。应镇光等[20]指出，Nrf2/ARE信号通路参与胃癌发生及耐药性的产生。本研究结果显示，与对照组和生理盐水组相比，丙泊酚组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1基因和蛋白相对表达量均降低，说明丙泊酚可能通过抑制Nrf2/ARE信号通路而发挥抗肿瘤作用。

Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的重要基因，Bcl-2可保护细胞避免凋亡，Bax则在促进细胞凋亡中发挥重要作用[21]。本研究结果显示，丙泊酚组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2基因和蛋白相对表达量降低，而Bax基因和蛋白相对表达量升高，说明丙泊酚促进移植瘤组织细胞凋亡的发生。笔者推测丙泊酚可能通过抑制Nrf2/ARE信号通路及下游保护性基因的表达，促进细胞发生凋亡。

综上所述，丙泊酚可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长，其机制可能与抑制Nrf2/ARE信号通路，而促进细胞凋亡有关。