猪肝、牛肉、羊肉中5种β-受体激动剂残留的超高效液相色谱-串联质谱分析方法的建立

张苏珍 王益军 田 蕴 贺 燕 葛 敏

(连云港市畜产品质量监督检验测试中心，连云港222000)

β-受体激动剂是一类动物兴奋剂，具有促进蛋白质合成、降低脂肪沉淀等作用，当它们被用于家畜饲粮时，能显著提高胴体的瘦肉率和饲料转化率。由于用于家畜生产的β-受体激动剂通常剂量高，用药时间长，因此容易造成畜禽产品中β-受体激动剂残留超标，通过食物链的传递，最终被消费者食用，造成人体内的残留和蓄积损伤[1-3]。人在发生β-受体激动剂中毒反应时，会表现出严重的心悸、恶心、呕吐、心率加快等症状，严重的可能会危害生命健康[4-5]。我国农业部明令禁止将β-受体激动剂用于所有动物性食品。然而在利益的驱使下，仍有养殖户将β-受体激动剂应用于畜禽养殖过程中，因此建立畜禽产品中残留β-受体激动剂检测方法，通过生产链追溯至不法生产者，在食品安全监管中发挥着重要作用。

常见的β-受体激动剂检测方法有免疫检测方法(如酶联免疫法、胶体金免疫法、化学发光免疫法)和色谱法(高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法)[6-10]。近年来，随着液相色谱-质谱联用仪的广泛运用，β-受体激动剂的液质检测方法也不断地得到优化[11-20]。本文研究了猪肝、牛肉、羊肉中5种β-受体激动剂(图1)的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)快速检测分法，以期能为大批量畜禽产品中5种β-受体激动剂残留的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UPLC-TQS Micro超高效液相色谱-串联质谱仪，配备电喷雾离子源(美国Waters)；电子天平(德国赛多利斯)；高速冷冻离心机(德国Sigma)；固相萃取仪(美国Supelco)；氮吹仪(美国Organomation)；PRiME HLB固相萃取柱(美国Waters)；精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)；基本型圆周混合器、数显振荡摇床(德国IKA)。

图1 5种β-受体激动剂分子结构

5种β-受体激动剂：莱克多巴胺纯度为98.0%，克伦特罗纯度为99.1%，沙丁胺醇纯度为99.2%，西马特罗纯度为99.9%，氯丙那林纯度为99.9%。5种β-受体激动剂内标：莱克多巴胺-D3纯度为99.0%，克伦特罗-D9纯度为99.4%，沙丁胺醇-D3纯度为98.4%，西马特罗-D7纯度为99.3%，氯丙那林-D7纯度为99.8%。甲醇、乙腈为默克色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

标准储备液：称取5种β-受体激动剂标准品及内标标准品适量，分别用纯甲醇配制成1 mg/mL单标储备液。于-18 ℃避光保存。准确吸取5种β-受体激动剂标准品溶液适量配制成混合标准溶液，再用纯甲醇逐级稀释为1 μg/mL的混合溶液，5种β-受体激动剂内标混合溶液配制方法同上，于4 ℃冷藏保存。

1.2 分析条件

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity BEH-C18(2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)；进样量为4 μL；柱温30 ℃；流动相A：10 mmol/L乙酸铵(pH=5)，流动相B：10 mmol/L乙酸铵(pH=5) 甲醇溶液；流速为0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压0.6 kV；离子源温度500 ℃；去溶剂气流速1 000 L/Hr。

1.3 样品前处理

准确称取绞碎后试样2.00 g于50 mL离心管中，添加适量内标。加入10 mL的80%乙腈水溶液，漩涡1 min，振荡提取10 min，10 000 r/min离心10 min。取6 mL上清液直接加载到6 mL规格PRiME HLB固相萃取柱，保持1 s每滴流速，收集全部流出液，振荡混匀。取4 mL流出液在50 ℃下氮气吹至近干。用1 mL浓度为10%甲醇水溶液复溶，用0.2 μm微孔滤膜过滤，待测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

通过比较0.2%甲酸水溶液-40%甲醇乙腈溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液和10 mmol/L乙酸铵水溶液-10 mmol/L乙酸铵甲醇溶液(pH=5)3种流动相，发现当流动相中有乙酸铵存在时，峰型较好，响应值较高，因此，用10 mmol/L乙酸铵水溶液-10 mmol/L乙酸铵甲醇溶液(pH=5)作为流动相进行梯度洗脱，5种β-受体激动剂正离子扫描特征离子色谱图见图2。

表1 梯度洗脱程序

MRM: 多反应监测；RAC：莱克多巴胺；CLE：克伦特罗；SAL：沙丁胺醇；CIM：西马特罗；CLO：氯丙那林；RAC-D3：莱克多巴胺-D3；CLE-D9：克伦特罗-D9；SAL-D3：沙丁胺醇-D3；CIM-D7:西马特罗-D7；CLO-D7:氯丙那林-D7。

MRM: multiple-reaction monitoring； RAC: ractopamine; CLE: clenbuterol; SAL: salbutamol; CIM: cimaterol; CLO: clorprenaline; RAC-D3: ractopamine-D3; CLE-D9: clenbuterol-D9; SAL-D3: salbutamol-D3; CIM-D7: cimaterol-D7; CLO-D7: clorprenaline-D7.

图25种β-受体激动剂及其同位素内标的正离子扫描特征离子色谱图

Fig.2 Positive ion scanning characteristic ion chromatograms of 5 β-agonists and isotopic internal standard

2.2 质谱条件的优化

在电喷雾离子源正离子扫描(ESI+)模式下进行质谱条件优化。以5.0 μL/min的流速注入100 ng/mL的混合标准溶液，进行一级质谱扫描，获得合适的母离子条件，再对母离子进行二级扫描，调节碰撞能量和锥孔电压，筛选信号最强的子离子作为定量离子，信号次强的子离子作为定性离子，得出多反应监测条件：离子对、锥孔电压、碰撞能量(表2)。

表2 5种β-受体激动剂及其同位素内标多反应监测条件

2.3 方法线性和检出限

精密量取5种β-受体激动剂混合溶液，用10%甲醇水溶液稀释成浓度为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的标准工作溶液，含内标物浓度为5 ng/mL，供液相色谱-串联质谱仪测定。内标法以各特征离子质量色谱峰与相应同位素内标的峰面积比为纵坐标，对照溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线[6]。回归方程及相关系数见表3。由表3可以看出，5种β-受体激动剂浓度在0.5～50.0 ng/mL呈现良好的线性关系，线性相关系数(R2)在0.999 63～0.999 96。

根据特征离子色谱峰信噪比(S/N)=3计算方法的检出限，得出5种β-受体激动剂检出限为0.01～0.04 μg/kg。按照S/N=10得出5种β-受体激动剂定量限为0.02～0.15 μg/kg。

2.4 回收率

称取猪肝、牛肉、羊肉的空白样品，进行0.5、1.0、5.0 μg/kg 3个不同浓度的添加回收试验，按照1.3方法进行前处理，每个水平重复3次，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。结果见表4。5种β-受体激动剂回收率在猪肝中为93.7%～106.1%，牛肉中为95.2%～104.0%，羊肉中为95.1%～106.0%。结果表明，该方法具有较好的回收率，可以满足猪肝、牛肉、羊肉中5种β-受体激动剂残留的日常检测要求。

表3 5种β-受体激动剂回归方程及相关系数

表4 猪肝、牛肉、羊肉中5种β-受体激动剂的平均回收率和相对标准偏差

2.5 精密度

按照1.3前处理方法，分别称取猪肝、牛肉、羊肉样品，进行阳性添加，制备0.5、1.0、5.0 μg/kg 3个不同浓度的样品，每个水平重复6次，进行分析测定。计算相对标准偏差(RSD)。同样操作方法，连续测定3 d，计算日间精密度RSD,结果见表5。猪肝中5种β-受体激动剂日内精密度RSD为0.6%～4.5%，日间精密度RSD为0.5%～4.4%；牛肉中5种β-受体激动剂日内精密度RSD为0.9%～4.1%，日内精密度RSD为0.9%～5.3%；羊肉中5种β-受体激动剂日内精密度RSD为1.2%～3.6%，日内精密度RSD为1.2%～4.1%。结果表明，该方法具有较好的重复性和日间精密度。可以满足猪肝、牛肉、羊肉中5种β-受体激动剂残留的日常检测要求。

3 讨 论

3.1 前处理步骤优化

畜禽产品中含有大量蛋白质和脂肪，本试验中用乙腈/水溶剂沉淀蛋白质，通过离心去除蛋白质。然后用PRiME HLB小柱进行简单、快速的净化。一般固相萃取需要活化、上样、淋洗、洗脱4个步骤达到净化目的。本试验过程中，样品提取液直接上样至PRiME HLB固相萃取柱，既省略了以往固相萃取过程中的活化、淋洗、洗脱3个步骤，又去除了样品中的脂肪等复杂基质，实现了一步净化，净化后的样品溶液通过24孔氮吹仪浓缩，实现批量快速处理，试验前处理省时高效，可提高检测效率。

表5 猪肝、牛肉、羊肉中5种β-受体激动剂的精密度相对标准偏差

3.2 液质条件的优化

本法通过比较不同流动相对色谱峰的影响，最终确定用10 mmol/L乙酸铵水溶液-10 mmol/L乙酸铵甲醇溶液(pH=5)作为流动相进行梯度洗脱，通过优化液相梯度洗脱条件，使5种β-受体激动剂的出峰时间在6 min以内，可获得较好的峰型。

采用电喷雾离子源正离子模式扫描，获得5种β-受体激动剂的母离子和子离子信息，确定最佳定量离子对和定性离子对。通过对离子源参数进行优化，获得较好的响应值。

4 结 论

① 当5种β-受体激动剂浓度为0.5～5.0 μg/kg时，猪肝中回收率为93.7%～106.1%，牛肉中回收率为95.2%～104.0%，羊肉中回收率为95.1%～106.0%。

② 5种β-受体激动剂检出限为0.01～0.04 μg/kg，定量限为0.02～0.15 μg/kg。

③本试验方法具有较好的准确度和重复性，操作简便，灵敏度高，准确度好，适合大批量畜产品中β-受体激动剂残留的检测分析。