乳制品中选择性分离与计数植物乳杆菌的方法

张耀广，李兴佳，屈雅莉，柴艳兵，李飞，赵媛媛，杨春杰

(君乐宝乳业集团，河北 石家庄，050000)

植物乳杆菌作为具有保健意义的功能性益生菌，不仅可以有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、单增李斯特菌的生长繁殖[1-5]，还能通过抑制肠道细菌的移位，抑制过度炎性反应，改善人体肠道菌群，参与调控肠道内稳[6-8]。植物乳杆菌不仅可以通过菌体细胞吸收胆固醇，降低人体内胆固醇的含量[9]，还能降解发酵过程中产生的亚硝酸盐，缓解铅毒性[10-13]，使发酵食品中的亚硝酸盐风险降低。基于以上优势，植物乳杆菌在功能性酸奶、发酵豆乳、干酪、功能性乳酸菌饮料等发酵乳制品中得到广泛应用[7,14-15]。

基于特异性引物的PCR技术已被应用于植物乳杆菌的检测[16-20]。但该种方法要求专业水平极高，不适用于生产企业的检测及推广。目前国内外有一些用于酸奶中常见益生菌计数和研究的选择性或鉴别性培养基[21-23]，但这些培养基只能将常用的菌种(双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌)分离开来，对于与植物乳杆菌亲缘关系极近的干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的分离计数，还未见相关研究报道。

无论是国内还是国际，对植物乳杆菌食品质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。因此，建立和健全发酵乳制品中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的分离与计数方法，对于我国发酵乳制品中植物乳杆菌检测及产品质量的把关，具有重要的实际意义。

本研究通过对MRS培养基中碳源的改良与优化、对抗生素的敏感度及产酸能力的研究，根据植物乳杆菌的生长特性，研制出植物乳杆菌分离计数培养基(LP-MRS培养基)，得到能够对发酵乳制品中植物乳杆菌的分离和计数培养基，建立一种操作简便、特异性强的植物乳杆菌分离计数方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

嗜热链球菌Streptococcusthermophiles(CICC 6038)、瑞士乳杆菌Lactobacillushelveticus(CICC 6032)、嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus(CICC 6069)、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei(CICC 6117)、植物乳酸杆菌Lactobacillusplantarum(CGMCC NO.1258)购自中国工业微生物保藏管理中心;乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcuslactissubsp.lactis(JLB-1105)、婴儿双歧杆菌Bifidobacterium(La-14)、鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus(LR1)、副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei(N1115)由实验室分离鉴定并保存。

1.2 培养基

植物乳杆菌分离计数培养基(LP-MRS培养基)：蛋白胨(10.0 g/L)、酵母粉(4.0 g/L)、吐温80 (1.0 mL/L)、K2HPO4·7H2O(2.0 g/L)、乙酸钠(3H2O)(5.0 g/L)、柠檬酸三铵(2.0 g/L)、MgSO4·7H2O(0.2 g/L)、MnSO4·4H2O(0.05 g/L)、麦芽糖(10 g/L)、琼脂(15.0 g/L)。

用法：按照上述配方称取各成分，溶解于1 L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调整pH值至6.0±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，待冷却至50 ℃，每100 mL基础培养基中无菌加入P-08B万古霉素1支，同时加入300 μL 1.6 g/L溴甲酚紫(乙醇溶解)，混匀后倾注平板备用。

MRS琼脂培养基、MRS液体培养基。

1.3 LP-MRS培养基对单菌株选择性效果试验

将9株活化后的菌株分别在LP-MRS平板培养基上划线，同时在MRS平板上划线，作为活力对照，36±1 ℃厌氧培养72±2 h后，观察菌株生长情况及菌落形态。

1.4 LP-MRS培养基对混合菌株选择性效果试验

从MRS平板上挑取纯菌落于生理盐水中，制备成108CFU/mL的菌悬液，将植物乳杆菌与乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌混合，作为第1组试验样品，将植物乳杆菌与乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌混合，作为第2组试验样品。

将以上2组试验样品按照1∶9进行稀释，得到10倍系列稀释液。选取2～3个合适的稀释度，分别取0.1 mL稀释液，加入到LP-MRS平板上，用涂布棒涂布均匀后，36±1 ℃倒置厌氧培养72±2 h，观察菌落形态。

1.5 LP-MRS培养基对植物乳杆菌计数的影响

将植物乳杆菌菌悬液进行10倍稀释，选取合适的稀释度分别在2块MRS平板上和2块LP-MRS平板上进行涂布，涂布均匀后，36±1 ℃倒置厌氧培养72±2 h，按照GB 4789.35—2016中计数方式进行计数。每种培养基进行5个重复，计算相对误差。

1.6 乳制品中植物乳杆菌的分离计数

以无菌操作称取25 g样品，置于装有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶内，置于涡旋混匀器上振荡2 min，制成1∶10样品匀液。用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释1次，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。

根据待检样品活菌总数的估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液分别置于2个MRS和LP-MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。36±1 ℃厌氧培养72±2 h后计数平板上的典型菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15 min内完成。选取菌落数在30～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

2 结果与分析

2.1 LP-MRS培养基对单菌株选择性效果试验

结果表明，乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌在LP-MRS平板上受到抑制，均无生长；鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌在平皿上不受抑制，均能生长(见图1)。

培养72 h后，副干酪乳杆菌在LP-MRS培养基平板上菌落为乳黄色，圆形，边缘整齐，直径1～2 mm大小，周围培养基变黄；干酪乳杆菌菌落白色，圆形，边缘不整齐，直径0.5～1 mm大小，周围培养基颜色不变，为蓝紫色；鼠李糖乳杆菌菌落白色，圆形，边缘整齐，直径1～2 mm大小，周围培养基颜色不变；植物乳杆菌菌落呈“煎蛋状”，有黄色实心，周围有乳圈，圆形，边缘整齐，直径2～3 mm大小，培养基颜色由蓝紫色变成黄色。

2.2 LP-MRS培养基对混合菌株选择性效果实验

植物乳杆菌与乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌混合培养72 h后，LP-MRS平板上只有植物乳杆菌生长，菌落呈“煎蛋状”，黄色实心，周围有乳圈，圆形，边缘整齐，直径2～3 mm大小，培养基颜色由蓝紫色变成黄色(图2上)。

植物乳杆菌与乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌混合培养72 h后，LP-MRS平板上有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌生长，但植物乳杆菌在培养基上呈现特有的菌落特征：菌落黄色实心，周围有乳圈，圆形，边缘整齐，直径2～3 mm大小，培养基颜色由蓝紫色变成黄色，其他菌落无“煎蛋状”特征，因此，可以将植物乳杆菌从中分离开来，且不同浓度下，植物乳杆菌均易于辨识(图2下)。

1-嗜酸链球菌；2-瑞氏乳杆菌；3-婴儿双歧杆菌；4-嗜热链球菌；5-乳酸乳球菌乳酸亚种；6-鼠李糖乳杆菌；7-植物乳杆菌；8-干酪乳杆菌；9-副干酪乳杆菌;左：MRS；右：LP-MRS图1 不同乳酸菌在MRS和LP-MRS上生长情况Fig.1 The growth in the MRS medium and LP-MRS medium of different lactic acid bacteria

上：第1组；下：第2组图2 植物乳杆菌的分离Fig.2 The isolation of Lactobacillus plantarum

结果表明，LP-MRS培养基可用于含乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌混合菌株样品中的植物乳杆菌的分离。

2.3 LP-MRS培养基对植物乳杆菌计数的影响

表1 植物乳杆菌在MRS和LP-MRS上数量 成组法T检验分析Table 1 Group T test analysis of Lactobacillus plantarum on MRS medium and LP-MRS medium

由表1可知，用成组法T检验分析MRS平板和LP-MRS平板进行植物乳杆菌的菌落计数，两者没有显著性差异(p=0.783 4)。结果表明，LP-MRS培养基中的营养成分和万古霉素对植物乳杆菌的计数没有影响，该培养基可用于植物乳杆菌的计数。

2.4 乳制品中植物乳杆菌的分离计数

结果表明(表2)，植物乳杆菌与常用的益生菌混合发酵后，无论是发酵乳、活菌型乳酸菌饮料，还是固体菌种，均能用LP-MRS培养基检测植物乳杆菌的数量。LP-MRS培养基可以满足市售乳制品中植物乳杆菌的检测与计数需求。

3 讨论

越来越多的乳制品应用植物乳杆菌作为添加菌种，但对于植物乳杆菌的检测与计数方法研究甚少。因此，建立乳制品中植物乳杆菌的检测和计数方法，已成为当务之急。

随着分子生物技术的发展，实时荧光PCR技术已在微生物定性及定量研究中得到广泛应用。陈臣通过荧光定量PCR技术，以RNA反转录的cDNA为模板，建立植物乳杆菌的定性及定量检测方法，但该方法的检出限为2.26×102CFU/mL[17,19]，且RNA易降解，对人员技术要求极高，实际应用中具有一定的难度。孙凯等利用DPO引物，结合SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR技术，建立植物乳杆菌的检测方法，但该方法只能对样品中的DNA含量进行定量，无法对样本中的菌落数进行分析[20]。且对于生产企业而言，分子生物方法成本高，对人员要求严格，很难在企业中得到推广应用。

表2 乳制品中植物乳杆菌的分离计数Table 2 Enumeration of Lactobacillus plantarum separated from dairy products

部分学者利用山梨醇-MRS培养基进行植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌中植物乳杆菌的计数，但对于与植物乳杆菌相似的干酪乳杆菌群来说，该方法不能将植物乳杆菌分离开来[24]。

本研究基于植物乳杆菌产酸能力及对抗生素敏感程度不同，建立了植物乳杆菌的检测和计数方法。该方法通过不同菌株对万古霉素的敏感性，将植物乳杆菌与乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌、瑞氏乳杆菌、嗜酸链球菌、婴儿双歧杆菌区分开来，利用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌产酸能力及麦芽糖利用不同，将植物乳杆菌分离。通过比较植物乳杆菌在LP-MRS培养基和MRS培养基中的计数结果，表明该培养基对植物乳杆菌计数无影响，可以用于植物乳杆菌的计数。对12份不同的乳制品进行植物乳杆菌计数，表明该方法适用于乳制品中植物乳杆菌的分离计数。该方法操作方便、成本低、对人员要求低，检测程序与乳酸菌总数的国家标准流程一致，适用于乳制品企业对产品中植物乳杆菌的检测和计数，可得到广泛的推广应用。