纳米抗菌剂在食品中的应用研究进展

路玲，李莉，罗自生

(浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州,310058)

纳米技术是20世纪80年代末期崛起并正在迅猛发展的新型前沿高技术，涉及现代物理学、化学、生物学、医学、材料科学、信息科学、能源科学和先进制造科学，是一门高度交叉学科。纳米技术是研究在纳米尺度(通常指1～100 nm)下材料的性质和应用。利用纳米技术可以使人类认识与改造物质世界的手段和能力延伸到原子和分子。在纳米尺度下，物质具有量子尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应等特点[1]，展现出与宏观尺度下物质的物理、化学、光学、力学、生物学等不同或宏观不具备的特性。目前，纳米科技已经对世界产生了深远影响，形成了大量的科技和产业成果，促使材料、能源、环境、微电子、生物和医药等产业领域发生了重大变革。

1 纳米技术在食品行业的兴起

纳米技术在农业、食品等领域有巨大发展前景，如纳米封装农药、化肥、纳米抗菌食品添加剂、纳米乳液、食品抗菌包装、快速探测病菌及其他污染物的纳米传感器等[2-3]，其中运用纳米粒子(纳米Ag、纳米ZnO等)的食品抗菌膜及其他表面接触类食品包装能够有效延长食品的货架期，防止食品腐败变质[4]。许多细菌，包括致病菌能够在食品表面或工业设备中形成生物膜，此类生物膜对于大多数消毒灭菌方法都有抗性，因而成为食品工业中重要的污染源。运用纳米形态学方法可以防止这些生物膜的产生[5]，纳米表面结构可以破坏表面形态，且不需要能量供应和与其他物质的结合。然而纳米级物质对于人体健康和环境的潜在风险也必须得到充分评估以确保消费者能够接受。

2 食品接触用抗菌纳米粒子

食品抗菌膜及其他抗菌包装可以在食品的生产、加工、贮藏过程中保持食品卫生，抑制微生物活性及防止微生物入侵。目前应用最广泛的纳米抗菌剂及其在食品中的应用如表1所示。

抗菌膜可使用纳米金属材料或金属氧化物如Ag，具有光催化活性的纳米粒子如纳米TiO2、纳米ZnO等。光催化作用需要光(通常是350 nm的紫外光)和活性氧来氧化或破坏细菌的组织[6]。近年来利用可见光来进行光催化作用已经有了一定的研究和发展[7-8]。可见光催化最常用的方法是染料敏化[9]，添加铜离子或引入新型材料如钒酸铋(BiVO4)，这些材料已经成功运用到光催化型抗菌膜中。

纳米技术可以改善活性包装的机械性能和热力学性能，更好地保障食品的质量与安全。在生物聚合物中添加纳米化黏土可提高其机械性能，可用来制备可生物降解的环保食品包装。在抗菌膜中添加生物活性分子和纳米抑菌粒子也可以防止食品的氧化和降解。备受关注的新型包装材料纳米纤维素[10]与其他纳米粒子如光催化剂混合可制备抗菌膜，作为控释抗菌剂的载体；天然纳米抗菌物质如纳米化肉桂酸对大肠杆菌表现出很强的抗菌活性[11]。纳米粒子具有特殊物化特征，将其与成膜基质复合能够改善单一抗菌膜的机械性能。纳米技术的抗菌作用也常用于医疗领域[12]。食品包装膜常用的纳米粒子有纳米TiO2[8-9]、纳米SiO2[13]、纳米CaCO3[9]、纳米山梨酸、纳米Ag等。

表1 主要纳米抗菌剂及其在食品中的使用情况Table 1 The main nano antibacterial agents and their use in food

抗菌纳米粒子分为3种基本类型：金属及金属氧化物纳米粒子、天然纳米抗菌物质、碳基纳米粒子[14]。多种多样的纳米粒子具有独特的物化性质，比表面积大，具备高效抗菌活性。这些纳米粒子与微生物细胞的作用机制有：(1)活性氧的光催化产物破坏微生物细胞成分；(2)破坏细菌细胞壁或细胞膜；(3)阻断跨膜的电子转移；(4)抑制酶活性和DNA的合成。新型的高效纳米抗菌剂及纳米抗菌材料应用前景十分广泛，根据现有的研究我们应进一步探索其抗菌活性的影响机制。

3 纳米抗菌剂

3.1 纳米Ag

金属及金属氧化物纳米粒子的抗菌性已有大量研究[15]，如Ag、TiO2、ZnO、Fe3O4等。其中纳米Ag因其突出的抗菌活性而成为应用最广泛的高效抗菌剂[16]，在食品、医药、纺织品领域都有应用。银是一种对微生物有强毒性的元素，因其具有广谱抗菌性，市场上许多产品都有对银的使用。银一般以离子或金属形式存在。纳米Ag材料比一般金属银具有更强的抗菌性能，因为其体积小，比表面积大，更易穿过细胞壁和细胞膜进入细胞质中。据研究三角形或截断形的粒子的杀菌能力比杆形和圆形的粒子更强[17]。银离子的抗菌机制主要是：银离子会与细菌的细胞壁、细胞膜中蛋白质的含硫和磷的基团作用，使之失去细胞活性并使蛋白质凝集；银离子在膜带负电的部位会导致原生质体穿孔，细胞内物质外流以致细胞死亡。一些银离子穿透细胞膜进入细胞质中，破坏细菌的蛋白质和核酸。纳米Ag一旦进入细胞，就会攻击细菌的DNA和呼吸酶，影响遗传物质的复制和细胞分裂，并最终使细胞死亡。生物可降解包装中加入Ag可以增强其抗菌性和抗污染性能。纳米Ag粒子的形态学特征会间接影响Ag+的释放，因此通过操控氧气，粒子的大小、形状和包装类型可以调节 Ag+的释放从而控制其抗菌能力。纳米Ag的抗菌力取决于许多因素，如几何形状、表面积、氧化情况、附聚行为、表面电荷和表面官能团等，释放介质的盐度、其他分子的存在、温度、光照、氧气也都会影响纳米Ag的活性。

制备纳米Ag微粒可以通过电化学、化学、热分解、微波照射、紫外线照射等方法。目前，纳米Ag粒子主要是基于湿化学还原法来制备，这些方法可以有效控制纳米Ag离子的大小和形状，但也存在一些问题，如胶体稳定剂的使用，产物不纯等。CAVALIERE等[18]首次运用超声波束沉积法来制备了纳米Ag薄膜。

纳米Ag材料已经被加入到淀粉、琼脂、芭蕉粉、明胶中，还与氧化石墨烯共同作用，几乎可以抑制100%细菌的侵袭。纳米Ag粒子对许多致病菌包括病毒、真菌及多种细菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌都有高效的抑制作用[19]。HOSSEINI等[20]对比了含纳米Ag材料的抗菌包装和不含纳米Ag的抗菌包装对于双钩对虾的抗菌效果，研究结果表明纳米Ag微粒有助于减少微生物数量，延长对虾的货架期。KANMANI等[21]的研究结果证实含纳米Ag的明胶纳米抗菌膜对于食源性致病菌表现出很强的抗菌活性，能够有效延长食品货架期，保持食品质量安全，在活性食品包装领域有很大应用前景。除较强的抗菌性外，纳米Ag还可以吸收鱼、肉类渗出的液体和水分，使其保持新鲜的外观[22]。纳米Ag对于膜的物理性能也有一定影响，LI等[23]将纳米Ag及纳米TiO2加入到聚交酯聚乳酸膜中，经检测膜的抗拉强度和弹性系数略有降低，断裂伸长率提高。纳米Ag粒子也可用来抑制生物被膜的形成，许多研究已经表明其具备很强的抗生物被膜活性，但其中精密的作用机制尚待研究。银改性光催化剂不仅可以作为增效抗菌剂，而且还能够作用于对银具有抗性的微生物，这种材料在有光和黑暗的条件下都具有抗细菌和抗病毒活性[24]。

壳聚糖与纳米Ag复合成膜不仅增强膜的抗菌性还能增强金属粒子的稳定性，壳聚糖-银纳米材料可以通过化学、热力学、γ射线、紫外线、电化学方法制得。壳聚糖-银纳米抗菌材料的抗菌活性随纳米Ag微粒数量的增加而增强[25]。因此抗菌材料的纳米级表面结构能够吸附的纳米Ag微粒的数量对其抗菌性能至关重要[26]。LATIF等[27]研究了固液2种形态的壳聚糖-银纳米抗菌剂的抗菌效果，结果表明抗菌剂为固态时，其直接与微生物接触抗菌，而抗菌剂以液态形式作用时可以在琼脂平板上分散开来因而表现出更强的抗菌能力。研究结果显示，用柠檬酸钠作为银的还原剂制备壳聚糖-银纳米微粒比用其他还原剂表现出更强的抗菌能力。此外壳聚糖与纤维素的共价连接也能够提高抗菌剂的抗菌性。

纳米Ag对于食源性致病菌具有很强的抑菌活性，有研究显示纳米Ag抗菌膜的抗菌效率高达98%，即使膜浸泡在去离子水中7 d，这个比率仍不会下降，且纳米Ag抗菌膜的作用机制是抑制细胞生物活性，对死细胞不产生作用[28]；但纳米Ag作为抗菌剂也尚有一些不足，KERNBERGER-FISCHER等[29]研究了纳米Ag对猪肉的保鲜抗菌作用，结果表明纳米Ag对于猪肉上生长的细菌没有明显作用。且目前其安全性还不能得到保证，纳米Ag会通过各类产品释放而透过生物膜与蛋白质等大分子结合，还会引发生物细胞生成活性氧，产生细胞毒性，据研究，1.0 mg/L的纳米Ag会产生明显的细胞毒性。此外，纳米Ag易聚合、Ag+释放不易控制等缺点也限制了它的应用[25]。

3.2 纳米ZnO

纳米级的ZnO具有广谱高效抗菌性及紫外吸收性能，在抑制微生物生长和抑制生物被膜形成方面具有巨大潜力，不同于纳米Ag， 目前纳米ZnO精确的抗菌机制尚不十分清楚[30]。一些研究已经证实ROS(活性氧簇，包括H2O2、 O2-、·OH等)的形成是其主要的抗菌机制[31]，其他抗菌机制也有报道如纳米ZnO与细胞膜作用导致微生物表面的破坏[32]，其释放的Zn+也具有抗菌性，随温度升高，纳米锌粒子的迁移率升高，微波处理也可以促进锌粒子的迁移。一些因素会影响纳米ZnO的抗菌活性如体积[33]、表面积、浓度、pH或其他抗菌剂的存在等。ZnO相对廉价且高效，对多种微生物都有抑制作用，包括致病菌如肺炎杆菌、李斯特菌，沙门氏菌 ，变异链球菌，乳杆菌，大肠杆菌，霉菌等，且对人体细胞无毒性。ZnO还被美国食品及药物管理局列入GRAS(generally recognized as safe)材料，可作为食品添加剂使用，是纳米抗菌剂中安全性相对较高的种类。许多研究已经证实纳米ZnO对革兰氏阳性菌的抗菌活性比革兰氏阴性菌强，这可能是由于其细胞膜结构的不同。纳米ZnO在水中性质不稳定，因此制造商会使用一些表面修饰剂来提高纳米ZnO的稳定性。

纳米ZnO被广泛应用于多种商品如食品、纺织品、药物中，可以醋酸锌作为前体物质经共沉淀作用在有机溶剂或水中人工制备[34]，目前其商业化生产主要有两种方法:机械化学加工和物理气相合成[35]。OUN等[36]制备了以角叉胶为基质材料的功能性水凝胶及干胶膜，其中加入金属纳米粒子：ZnO、CuO及两者的混合物，加入KCl作为交联剂以增强凝胶的抗拉强度，纳米粒子的加入会减弱角叉凝胶的透明度，降低膜的紫外光透过率，还会使角叉胶膜的溶胀率从2 980%增长到3 535%，研究表明含纳米ZnO的角叉胶膜对食源性致病菌如大肠杆菌、李斯特菌等具有很强的抗菌能力。匡衡峰等[37]的研究表明纳米ZnO能很好地融入壳聚糖基体中，能改善壳聚糖膜内部结晶，并能提高复合膜的抑菌圈效果，且低浓度复合膜抑菌圈效果更明显。LI等[30]的研究显示添加ZnO的聚亚安酯包装膜具有显著的抗菌性能，且相比单一聚亚安酯膜其抗摩擦能力和抗拉强度都有所增强。LI等[38]将纳米ZnO加入低密度聚乙烯包装中用于桃子的保鲜，实验结果表明该包装可以形成低O2，高CO2的气体环境，有利于桃子的保鲜，同时增强其耐冻性。

3.3 纳米TiO2

纳米TiO2具有广谱、高效的抗菌性和防紫外线、超亲水亲油、化学性质稳定等多种特性，其抑菌性能尤为显著，是目前研究较为广泛的无机纳米粒子，此外，TiO2也已被美国食品和药物管理局批准用于人类食物中并且混合在食物接触材料中。1977年FRANK和BARD首次将TiO2用于含氰化物的水的纯化，此后TiO2被广泛应用，包括大气和水污染的控制系统。

与其他纳米抗菌剂相比，当被紫外线照射时，TiO2表现出很强的光催化氧化性。TiO2的光催化抗菌性是指它在暴露于近紫外区射线和长波紫外线时能促进活性氧簇(ROS)的形成，活性氧簇破坏细菌的细胞膜、DNA和其他大分子物质。摧毁细菌细胞有2个阶段，第一个阶段是氧化作用破坏细胞壁，单细胞仍能存活，随着光催化作用的进行，TiO2粒子引发的氧化将会彻底杀死细胞 。动力学数据显示细胞壁的破坏发生在20分钟内，接着细胞膜和细胞内物质会被进一步破坏。纳米TiO2还具有与光催化活性氧簇无关的抗菌机制，但这种机制还未被充分研究。微生物灭活受很多因素影响，如TiO2的浓度、微生物类型、光的强度和波长、羟基化作用强度、pH、温度、氧容量、ROS的保留时间等。研究表明纳米TiO2对于不同微生物的抗菌效率为大肠杆菌>绿脓杆菌>金黄色葡萄球菌>屎肠球菌>白色念珠菌，其抗菌效率的不同主要取决于细胞膜/壁的复杂度和强度。不同微生物对于光催化的敏感度不同：病毒>革兰氏阴性菌>革兰氏阳性菌>酵母>丝状真菌。TiO2的光催化抗菌性具有很强的杀菌潜力，与金属或金属氧化物混合后可提高其可见光吸收率，从而提高在紫外光照射下的光催化活性。

在TiO2中加入Ag可显著提高抗菌活性[39]。有研究表明温度升高可以促进纳米钛粒子的迁移，更好地发挥其抗菌性。纳米TiO2与壳聚糖进行复合还可具备双效抗菌性；ZHANG等[7]在壳聚糖中加入纳米TiO2微粒制备的壳聚糖-TiO2抗菌膜对于食源性致病菌表现出很强的抗菌活性，是具有广阔前景的食品包装材料。利用电子显微镜观察到纳米TiO2微粒可以均匀分散到壳聚糖基质中，纳米TiO2可提高复合膜的亲水性和机械性能，降低可见光透光率，复合膜可在12 h内杀灭所有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉。 XING等[40]研究了聚乙烯-TiO2纳米抗菌膜的抗菌性能及物理性能，研究结果表明经过紫外光照射后抗菌膜的抗菌性能有一定提升，即紫外光照射60 min后可杀灭89.3%的大肠杆菌和95.2%的金黄色葡萄球菌，与纯聚乙烯膜相比，纳米TiO2的添加增强了膜的抗拉强度和延展率，其耐环境变化的能力也有所增强，水蒸气透过率从18.1 g/(m2·24 h)增加到24.6 g/(m2·24 h) 。LI等[41]研究了纳米TiO2改性低密度聚乙烯包装对草莓采后质量和抗氧化能力的影响，结果表明其对草莓菜后质量和抗氧化活性的益处主要是由于ROS和抗氧化酶的作用。纳米TiO2改性 LDPE 薄膜有利于保持草莓的贮藏品质，其作为草莓保鲜包装具有潜在的应用前景[42]。同样的包装也可用于太平洋白虾[43]、山核桃[44]等的保鲜，可保持其品质，延长货架期。

3.4 纳米MgO

纳米MgO廉价易得，具备生物兼容性，是极具发展前景的抗菌剂。氧化镁的光催化活性比纳米TiO2弱得多，纳米MgO不需要光照就可以有效的杀菌，且物理吸附作用强，不易变色。与纳米ZnO类似，目前认为MgO表面的活性氧如超氧离子是其具备抗菌能力的主要因素之一[15]。也有研究认为MgO的抗菌机理是MgO极易水合，在表面形成Mg(OH)2，溶液中的溶解氧通过单电子还原反应生成活性氧离子(02-)，而02-在碱性环境中具有化学稳定性，高浓度的02-得以存在于MgO表面。因此，强氧化性的02-破坏细菌膜壁的肽键结构，从而杀灭细菌。纳米MgO表面存在边、角位置和其他的反应缺陷位置，从而具有高表面集中的反应“表面离子”，由于具有较高的表面反应活性，可以吸附卤素形成纳米MgO/X2加合物，在保持了卤素高的化学和生物活性的同时，还具备了新的物理化学性能，并比气体更加安全和便于贮存，可用以制备新复合材料。纳米MgO与卤素的加合物能迅速杀死、抑制细菌、霉菌、芽孢以及病毒。是由于加合物为正电势，和负电势的细菌电荷相反，造成纳米粒子和卤素的加合物与微生物细胞相互吸引，进而杀死细菌和芽孢。

以纳米镁化合物改性壳聚糖涂膜，能改善涂膜的力学性能和透O2、CO2性能，还可增强其抗菌性能。镁化合物纳米粉体表面的活性基团与壳聚糖作用，导致壳聚糖的FormⅠ晶型减少，FormⅡ晶型发生改变。添加 Mg2(OH)3Cl 纳米片和纳米 MgO 颗粒后，壳聚糖复合涂膜的力学性能增强，透湿性能减弱；然而由于MgO纳米棒和MgO纳米小球在涂膜中存在团聚现象，所以导致壳聚糖与纳米粉体不能很好结合，涂膜内产生空隙甚至裂缝，涂膜机械性能下降及透湿性能增强。添加纳米 MgO 颗粒对壳聚糖涂膜的透O2、CO2性能改良效果最佳[45]。

3.5 纳米CaCO3

纳米CaCO3具有价格低廉、无毒、无刺激性、色泽好、白度高等优点，其作为塑料填充超细级物质，在改变制品性能方面有特殊效果，因而在食品行业也有较为广泛的应用。研究表明，将纳米CaCO3助剂加入到壳聚糖保鲜膜中可显著抑制多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，延缓鲜切甘蔗[46]的褐变，延长其货架期。纳米CaCO3改性聚乙烯膜对2 ℃下杨梅果实贮藏品质和生理具有积极作用，相对于普通聚乙烯膜，更有利于在包装袋内更快的形成低O2和高CO2的环境，保持杨梅果实品质[47]。徐晓玲等[48]用硬脂酸改性纳米CaCO3，将其作为助剂添加到壳聚糖中，可延缓枇杷硬度和酸度的下降，减少34%的水分损失。

3.6 纳米化山梨酸

山梨酸是一种双重不饱和脂肪族直链单羧酸，是一种安全性较高的酸性防腐剂，广泛应用于食品、饲料、医药、烟草及化妆品等行业。山梨酸常用于肉类食品的抗菌保鲜，纳米化处理后可改善其物化性能，提高抗菌效率。纳米山梨酸对于作用环境有一定的选择性，在酸性条件下，山梨酸能够很好地抑制霉菌、酵母菌以及好氧菌的生长，起到防腐作用；同时，纳米山梨酸的抗菌机理不同于其他几种抗菌剂，其双烯键同食品中的微生物酶的琉基结合形成共价键，使琉基失去活力，从而抑制微生物的繁殖，达到对食品防腐保鲜的作用[49]。但山梨酸水溶性差，实际应用中一般将其制备成钾盐，以方便溶解及添加，真正具有抑菌作用的是未解离的山梨酸分子，这是在中性或弱碱性食品中添加山梨酸钾不能发挥防腐保鲜作用的根本原因。为此，以食用山梨酸为原料，制备一种不依赖使用环境值、同时具有良好水溶性的纳米化山梨酸乳剂具有重要的意义。武陶等[50]将山梨酸作为被包封活性物质，通过离子凝胶法制成山梨酸壳聚糖纳米粒，用于肉品的保鲜，克服了山梨酸水溶性差的缺点，同时具备一定的缓释特性，研究表明山梨酸纳米防腐颗粒的最优制备工艺为壳聚糖质量浓度1 mg/mL、三聚磷酸钠质量浓度0.5 mg/mL、交联时间30 min、山梨酸质量浓度1 mg/mL，该条件下山梨酸颗粒平均粒径为337.2 nm，包封率为74.3%。

4 结论与展望

纳米科技在食品领域应用前景十分广阔，将纳米抗菌粒子用作食品抗菌剂加入到食品抗菌膜中可显著提高抗菌膜的抗菌性能和某些机械性能如透光性、抗拉强度等。但纳米抗菌剂的研究应用也存在一些挑战，如安全问题，纳米Ag和纳米TiO2都具有一定程度的毒性，与食品的长时间接触可能会对人体健康产生负面影响，如银富集到较高浓度时对人体和哺乳动物有较大危害，会伴随呼吸进入线粒体、胚胎以及肝脏和循环系统等；纳米抗菌剂的某些抗菌机制也未被充分研究，如纳米粒子如何与DNA、蛋白质等物质相互作用等。多种抗菌剂结合使用或与可降解的生物大分子物质如壳聚糖、纤维素等复合制备的多效抗菌膜成为当前研究热点，纳米抗菌剂的智能化应用也将成为进一步研究方向。