三黄鸡免疫重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗血清抗体检测试验报告

禽流感（avian influenza，AI）是禽流感病毒（AIV）感染家禽后引起的各种综合征，从无临床症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病不等。根据禽流感病毒的致病性和毒力的不同，可将其分为高致病性禽流感（HPAI），低致病性禽流感（LMPAI）。高致病性禽流感可导致严重的家禽群体发病和死亡，不仅给家禽养殖业带来毁灭型的打击，还可以不断地跨种间传播感染人类，人感染后死亡率高达60%。其中H5N1与H7N9就是近年两种常见人禽共患禽流感病毒亚型。且H7N9流感病毒已由原来的对禽的低致病性变异为高致病性，自2016年12月～2017年5月，两广地区出现暴发式禽流感H7N9疫情，并且多地有人感染H7N9的报道。我国决定从2017年秋季起，在家禽全面免疫禽流感H5的基础上，逐步全面开展H7N9免疫。为了解重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活苗免疫在不同地区不同养殖场的免疫效果，本试验团队于2017年10月，在贺州市随机选取了4个三黄鸡养殖场开展了疫苗免疫与血清抗体检测试验。本试验的完成不仅可以了解贺州市不同地区三黄鸡养殖场的H5及H7亚型禽流感抗体水平，还可以根据检测结果，了解抗体消长规律，指导养殖场制定合理的免疫程序，为有效的防控禽流感的发生与流行提供参考依据。

一、材料与方法

1.试验鸡群。在贺州市选择4家饲养水平良好的三黄鸡规模化养殖场，分别标记为A场、B场、C场、D场，全部采用全进全出养殖模式，养殖规模为9000-27000只。

2.试验疫苗。重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗，简称（H5+H7）二价灭活苗（下同），为国内某厂家生产，生产批号为：2017103。

3.检测试剂。禽流感H5亚型、H7亚型血凝抑制（HI）试验抗原及标准阳性血清购自哈尔滨维科生物技术有限责任公司。鸡红细胞混悬液（1%）及磷酸盐缓冲液（PBS）由本实验室自行配制。

4.试验分组与采样。A、B、C、D四家养殖场鸡只均在60日龄时进行第一次免疫，一免后第21 d进行第二次免疫，两次免疫的免疫剂量均为0.5 ml/羽，采取颈部皮下注射进行免疫接种。各场分别在免疫后第0 d、第15 d、第30 d、第45 d、第60 d随机选择60只鸡，翅静脉采血2 ml/羽，分离血清后-20℃保存，统一检测。

5.抗体测定。检测方法及结果判定参照GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术进行。

二、结果与分析

1.H5亚型血清抗体检测结果。1500份血清样品的H5亚型血清抗体检测结果见表1和图1。结果表明：该疫苗免疫三黄鸡后，可较好的刺激机体产生H5 HI抗体，且四个场的HI抗体消长规律基本一致，其平均抗体水平均呈现随日龄增加先上升后下降再平稳回升的明显变化。一免后H5 HI抗体迅速上升，在一免后第15 d时，四个场的抗体均可达到平均抗体滴度5.0 log2以上的合格水平。加强免疫后（一免后第21 d），H5 HI抗体迅速升高，该疫苗在加强免疫后第9 d（一免后第30 d）H5 HI抗体水平达到高峰，此时A、B、C、D四个场的H5 HI抗体滴度分别为9.27 log2、6.88 log2、8.15 log2、9.10 log2；到加强免疫后第39 d（一免后第60 d）H5 HI的抗体水平均保持在6.0 log2以上。此外，在一免后第15～60 d期间四个养殖场的抗体阳性率均高于80%。

表1 H5亚型血清抗体的检测结果

图1 不同日龄H5亚型血清抗体平均值的变化曲线

2.H7亚型血清抗体检测结果。1500份血清样品的H7亚型血清抗体检测结果见表2和图2。结果表明：该疫苗免疫三黄鸡后，可较好的刺激机体产生H7 HI抗体，且四个场的HI抗体消长规律基本一致，其平均抗体水平均呈现随日龄增加先上升后下降再平稳回升的明显变化。一免后H7 HI抗体迅速上升，在一免后第15 d时，四个场的平均抗体滴度最高可达到7.03 log2。加强免疫后（一免后第21 d），H7 HI抗体迅速升高，该疫苗在加强免疫后第9 d（一免后第30 d）H7 HI抗体水平达到高峰，此时A、B、C、D四个场的H7 HI抗体滴度分别为8.93 log2、6.22 log2、8.28 log2、9.20 log2；到加强免疫后第 39 d（一免后第60 d）H7 HI的抗体水平均保持在4.5 log2以上的合格水平。此外，在一免后第30～60 d期间四个养殖场的抗体阳性率均高于80%。

表2 H7亚型血清抗体的检测结果

图2 不同日龄H7亚型血清抗体平均值的变化曲线

三、小结与讨论

1.禽流感H5亚型血清抗体消长规律。对检测结果的分析表明，一免后第0 d H5抗体平均水平为0，说明在鸡60日龄时母源抗体已经消失。此时对幼鸡进行第一次免疫，21 d后进行第二次免疫，注射疫苗后逐渐诱导机体产生抗体。一免后第15 d抗体滴度快速上升，加强免疫后第9 d（一免后第30 d）抗体水平持续上升，但上升速率有所下降。第45 d抗体平均水平降至最低，说明一免产生的抗体水平开始下降，二免诱导产生的抗体上升速度不及下降速度。第60 d抗体水平已表现回升，说明二免后产生的抗体上升速度超过了一免产生的抗体的下降速度，家禽总体抗体水平升高，达到保护状态。

从结果来看，一免后第15 d至肉鸡出栏(第60 d)的时间段内，家禽抗体滴度均达到合格标准，说明该免疫程序可有效抵抗禽流感H5亚型病毒的入侵。

2.禽流感H7亚型血清抗体消长规律。检测结果显示，一免后0 d时H7抗体平均水平为0，说明此时母源抗体已经消失。此时对幼鸡进行第一次免疫，21 d后进行第二次免疫，注射疫苗后逐渐诱导机体产生抗体。第15 d抗体迅速升高，第30 d4个场的抗体水表现为持续快速上升，抗体平均滴度已经达到6 log2以上，最高为9.2 log2的较高水平。加强免疫后第24 d（一免后第45 d）抗体水平下降至最低，可见二免产生的抗体上升速度还未及一免后产生的抗体下降的速度。第60 d B、C、D场均表现为回升，表明一免产生的抗体持续下降，二免后产生的抗体逐渐上升至较高水平，可使机体继续保持较高的抗体效价，产生有效的抗体保护。

3.H5+H7二价灭活疫苗的免疫探讨。

（1）免疫方案的分析。使用该疫苗一免后第15 d时机体H5、H7抗体水平均明显上升，第15～30 d时抗体上升缓慢，第30 d（90日龄）后抗体开始下降。若没有进行第二次免疫，抗体水平持续下降，在出栏前（120日龄）出现疫情的几率和风险较高。二免后，机体第二次诱导产生的抗体逐渐升高，使得抗体水平停止下降甚至有所升高，在出栏前得到有效的抗体保护。因此，对肉鸡进行禽流感二次免疫是必要的；

（2）疫苗的应用推广。此疫苗在三黄鸡中对H5、H7均可产生较高的抗体水平，证明免疫效果确实。禽流感病毒既在家养禽类和野生禽类之间相互传播，又随候鸟迁徙，将病毒带到世界各个角落。对于这种传播迅速的疫情，H5+H7二价灭活疫苗应列入强制免疫计划，由试点到全国应用，加强商品禽和种禽的免疫，切实做好生物安全防护等多方面的防控工作。

（3） H5+H7二价灭活疫苗的优点。重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活苗属于全病毒灭活疫苗，具有制备工艺简单，免疫效果及安全性好、免疫持续时间长且不会出现毒力返强和变异的优点。选择二价苗可以减少免疫次数，提高免疫效率；

（4）存在问题。试验免疫程序首免日龄选择在60日龄，此时鸡只体内H5及H7抗体均为零。而本试验未了解幼鸡母源抗体的变化，在幼鸡母源抗体最低值时到进行第一次免疫后产生合格抗体水平的时间段内是否处于保护状态未知，因此免疫程序还有待优化。同样在不同的地域，品种不一致的情况下，合理的选择首免日龄，免疫剂量，免疫方案都是值得研究探讨的内容。

参考文献（略）