两种方法检测猪O型口蹄疫免疫抗体的对比试验

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种烈性、急性、热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织列为必须报告的传染病。在世界上许多国家或地区都有发生和流行，对养殖业及相关行业造成了严重的经济损失。我国通过实施强制免疫来防控该病，而免疫后产生的抗体水平是评价疫苗质量和免疫效果的重要手段，也是制定合理免疫程序的科学依据。但在实际检测中，常因抗体检测方法不同而使结果存在一定偏差，同一份样品采用不同的方法得出不同的判定结果也偶有出现，因此选择科学合理的检测方法，是进行科学评价免疫质量的基础。因此，本检测室使用口蹄疫病毒 VP1 结构蛋白抗体竞争ELISA试剂盒和口蹄疫液相阻断ELISA 检测试剂盒对口蹄疫O型免疫抗体进行检测并作对比分析。

竞争ELISA抗体检测是应用间接竞争法的模型将抗原包被，用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。本法使将小分子抗原包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗体与酶标板上的抗原结合。然后加入HRP酶标记的抗体，此抗体也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固定了一定数量的抗原，因此当样本中抗体的量越多，则HRP酶标记抗体可结合的包被抗原就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以为竞争法。

液相阻断ELISA 抗体检测是应用双抗体夹心法的模型，针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。适用于测定大分子抗原及对应的抗体，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原及对应的抗体，因为它不能形成两位点夹心。ELISA是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物发生有色反应。最终通过酶标仪的光吸收计算抗体（抗原）的量。

一、材料与方法

1.实验器材。单道、12道移液器若干、96孔U型反应板若干、37℃恒温生化培养箱、100 ml量筒、iMark-酶标仪。

2.血清样品。随机采集进行了猪口蹄疫O型灭活疫苗二次免疫后约40 d的95～120日龄育肥血液样品48份，分离血清，放置4℃冰箱保存待测。

二、诊断试剂

口蹄疫抗体O型竞争ELISA试剂盒为科研单位提供的试验用品，口蹄疫O型液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农科院兰州兽医研究所诊断中心，批号为20171205101-5。

三、检测方法及结果判定

1.口蹄疫抗体O型竞争ELISA。严格按试剂盒说明书进行操作，计算两孔的平均OD值后乘以0.6，该值即为临界值，表示阻断40%反应的对照OD值。待测样品OD值＞临界值，判为阴性孔；待测样品OD值 临界值判为阳性孔，阳性孔的最高稀释倍数即为该样品的抗体效价，抗体效价＞1∶16判定为抗体合格。

2.口蹄疫抗体O型液相阻断ELISA。严格按试剂盒说明书进行操作，计算两孔的平均OD值后乘以0.5，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD值。待测样品OD值＞临界值，判为阴性孔；待测样品OD值≦临界值判为阳性孔，阳性孔的最高稀释倍数即为该样品的抗体效价，猪血清抗体效价≧1∶64判定为抗体合格；牛血清抗体效价≧1∶128判定为抗体合格。

四、结果

经检测分析，竞争ELISA检测猪血清O型合格率为91.7%；液相ELISA检测猪血清O型合格率也为91.7%。两种方法检测猪血清O型抗体合格率符合度均为100%。

从检测抗体效价的整体结果来看，两种方法测得的抗体效价不存在明显的相关性，但当竞争ELISA测得的抗体效价≧1∶180时，竞争ELISA与液相ELISA的抗体效价为1∶2的关系；由于竞争ELISA测得的抗体效价≧1∶180的样品只有5份，若要证实此观点，还需更多的检测数据来支撑。

表1 竞争ELISA与液相ELISA检测猪O型口蹄疫免疫抗体结果

表2 猪血清样品抗体检测效价

(续表)

五、分析与讨论

检测结果显示，竞争ELISA与液相ELISA两种检测方法的抗体合格率完全符合，检测同一血清的抗体效价并无明显的对应关系，两种检测方法均有较高的敏感性和特异性，试验方法科学合理，试验结果真实可靠。

检测结果中竞争ELISA方法明显低于液相ELISA方法检测样品的抗体效价，可能是竞争ELISA方法使用口蹄疫病毒 VP1结构蛋白作为结合抗原，而液相ELISA使用口蹄疫全病毒作为结合抗原，全病毒含有结构蛋白和非结构蛋白，相比竞争ELISA方法反应程度更强。但随着稀释滴度的增加，抗原抗体反应特异性更加明显，受客观客观因素的影响会越来越小，两种方法测得的抗体效价对应关系趋于稳定。

两种方法都通过仪器设备判定结果，无人为因素干扰，这样会大大提高检测结果的准确性。相比竞争ELISA方法，液相ELISA操作步骤繁多，试验所需时间长，同时要求检测人员技术熟练，要求技术评估人员有较强的数据综合分析能力。

我国各省市、区县每年都要投入大量的资金来支持重大动物疫病防控免疫效果的评估工作，但检测结果常因疫苗来源的不同、检测方法及检测试剂不一致造成一定的偏差，尤其是在样本较少的情况下，检测结果的差异化更加明显。所以，笔者认为通过运用不同方法进行试验比对，探索出一套免疫抗体监测体系，能够更客观的评价疫苗质量，更全面的评估疫苗免疫效果及免疫效力，为疫苗用户提供更为优质化的技术服务。