乙烯基类聚合物对克雷伯氏菌和芽孢杆菌共培养的毒理效应

朱 超，王慧琴，孙斯蔚，张文婷，丁 泽

(陕西科技大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710021)

0 引言

乙烯基类聚合物是由含碳碳双键的单体经自由基聚合反应所得，由于具有良好的水分散性，能与胶原分子发生交联结合形成网状结构，并且其官能团可与胶原反应而使结构更加稳定[1]，故一直以来乙烯基类聚合物倍受皮革化学工作者的青睐[2].然而在其广泛应用的同时，由于未充分利用及处理不当，导致部分乙烯基类聚合物随工业废水进入水体环境中，很可能对水生生态系统的结构和功能造成影响.污水处理厂的活性污泥生化系统作为这类聚合物进入环境的第一道防线，是强化了的水体功能微生物集群，研究乙烯基类聚合物对其中模式种群的生物学效应及毒理学机制对于评价基于乙烯基类聚合物的各类制革化学品的生态风险和环境友好性具有重要意义.

近年来的研究表明变形菌门[3,4]和厚壁菌门[3-5]是活性污泥系统中参与有机物降解的优势种群.芽孢杆菌属是厚壁菌门中典型的孢子生成菌属[6]，其催化途径受葡萄糖和各种快速代谢底物的催化代谢物所抑制，其休眠态细胞较之营养细胞有更强的环境压力抵抗能力.克雷伯氏菌属[7]属于变形菌门，其广泛分布于土壤、植被和水体等环境中，参与各类生物和地球化学反应，是非临床胁迫环境中的主要微生物构成种群.许多克雷伯氏菌属成员都具备参与环境生物修复的特性.从多环芳烃-重金属土壤中分离纯化得到的一株雷伯氏菌JU1，在培养6 d 后对荧蒽的最高降解率可达 90%以上[8].

Ping L等[9]从土壤中分离得到雷伯氏菌菌株PL1，分别与20 mg/L 吡啶和10 mg/L苯并芘共培养10 d后，降解率分别达到63.4%和55.8%，对于受多环芳烃污染的土壤显示了巨大的生物修复潜力.而较之单一种群，混合微生物种群通过代谢协作往往表现出对于毒性有机物的强耐受性和共代谢降解能力.Poulsen等[10]报道了一些难降解污染物的好氧降解过程中包含了多种微生物种群的共代谢作用.Liao等[11]用高浓度磺胺培养筛选出具有降解能力的功能微生物群落，培养 4周后平均磺胺降解率为78.3%，优于单一种群降解的效果.从这个角度来说使用混合培养物进行目标化学品的毒性效应评价更符合实际微生物生态系统效能.

因此，本研究选取克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属作为模式种群分别从纯培养和混合培养水平考察四种乙烯基类聚合物的生物学效应，以期提供此类化学品的基础微生物生态效应.

1 实验部分

1.1 主要材料

受试菌株来源：分离自市政污水处理厂二沉池活性污泥中的克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)和芽孢杆菌属(Bacillussp.)菌株，二者NCBI登录号分别为KC753506和KC753503.甘油冷冻保存的菌株经牛肉膏蛋白胨液体培养基活化和牛肉膏蛋白胨固体培养基划线分离后，37 ℃恒温振荡(150 r/min)培养至OD600nm为0.305，浓度约为107CFU/mL时保存备用.

以表1中四种基于乙烯基类聚合物的皮革化学品作为评价对象，设置三个暴露浓度：100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L，将不添加任何化学品的培养物视为对照.

1.2 实验设置

纯培养设置：在超净工作台中，各取2.5 mL克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属扩繁菌液(见1.1)分别加入250 mL的锥形瓶中，并分别添加四种乙烯基类聚合物和牛肉膏蛋白胨液体培养基至100 mL并达到3个浓度水平，每个处理设置三个平行，37 ℃、150 r/min进行振荡培养.

混合培养设置：混合培养设置同纯培养设置仅接种液不同，为预先1∶1(体积比)混合的克雷伯氏菌和芽孢杆菌扩繁菌液，混合菌液接种量与纯培养暴露处理相同，总量为2.5 mL.

接种后0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h，108 h分别测定纯培养处理的和混合培养处理的pH值及OD600nm值.

1.3 乳酸脱氢酶(LDH)释放实验

LDH是一类稳定的胞内酶[12]，正常情况下在所有细胞中保持几乎相同的浓度，目前其作为一种生物标志物基于检测受损细胞释放的LDH活性，从而实现对体外细胞系统中的细胞毒性/细胞溶解进行快速简单地定量[13,14].因此，可通过LDH释放实验评估乙烯基类聚合物对供试菌株细胞膜完整性的影响.LDH活性通过细胞毒性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所：A020-1)进行测定，将培养12 h的纯培养和混合培养物分别在12 000 g下离心5 min，在离心后的50μL上清液中加入0.25 mL基质缓冲液(试剂盒配置)和0.05 mL的辅酶Ⅰ应用液(试剂盒配置)，混匀后于37 ℃水浴中孵育15 min后再加入0.25 mL的 2,4-二硝基苯肼，混匀后于37 ℃再次水浴15 min，再加入0.4 mol/L NaOH溶液，混匀后室温放置3 min后使用分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司，7200)在440 nm的波长下扫描记录吸光度.其中：乳酸脱氢酶释放率(%)=细胞外乳酸脱氢酶含量/(细胞内乳酸脱氢酶含量+细胞外乳酸脱氢酶含量)×100%[15].

表1 实验所用皮革化学品信息

注：DM为二甲基二烯丙基氯化铵，AM为丙烯酰胺，AA为丙烯酸，HEA为丙烯酸羟乙酯.

1.4 培养物胞内活性氧水平检测

为了阐明乙烯基类聚合物对供试菌株的可能抑制机理，使用2,7-二氯二氰荧光乙酰乙酸盐标记法[16](H2DCF-DA，分子探针，Invitrogen)检测了供试培养物细胞内的活性氧水平，以反映是否存在超氧自由基引起的胞内损伤[17].具体方法：将短期暴露(12 h)后培养液经400 g离心5 min后，使用0.1 M的磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗沉淀3～5次.使用0.1 M的磷酸盐缓冲液(pH7.2)配置终浓度为50μM的2,7-二氯二氰荧光乙酰乙酸盐溶液，加入清洗后的沉淀并在室温下避光孵育30 min，之后离心去除上清液，加入含有不同浓度类别乙烯基类聚合物的培养液(pH7.2)重悬沉淀，转移至96孔板放置5 h后经酶标仪在485 nm 激发光和520 nm发射光滤镜下记录产生的二氯荧光素强度，计算活性氧水平.

实验数据用 Origin 8.5进行制图，用 SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并用 Bonferroni 法在P=0.01的置信水平检验处理组之间的差异显著性.

2 结果与讨论

2.1 乙烯基类聚合物暴露对培养生境pH的影响

由图1(a)、(b)可知，在对克雷伯氏菌纯培养和芽孢杆菌纯培养过程中，分别添加了乙烯基类及纳米复合鞣剂和涂饰剂后的培养液pH值随时间的变化差异均较小，且稳定在6.7～7.3的范围内，其属于细菌生长适宜pH范围[18,19]，且与空白对照组的pH变化同样差异不大. 因此，乙烯基类及纳米复合鞣剂和涂饰剂聚合物的添加并没有对芽孢杆菌和克雷伯氏菌纯培养体系的pH产生影响，排除了由于培养过程中pH的波动对微生物生长的干扰.

(a)克雷伯氏菌纯培养

(b)芽孢杆菌纯培养图1 添加乙烯基类聚合物的克雷伯氏菌和芽孢杆菌纯培养过程中pH的变化

2.2 乙烯基类聚合物暴露对克雷伯氏菌和芽孢杆菌纯培养和混合培养生长的影响

为获得不同乙烯基类聚合物在各暴露浓度下分别对克雷伯氏菌和芽孢杆菌纯培养和混合培养生长的影响，用OD600nm值来表示细菌数目变化，即生长量变化.

图2为纯培养过程中不同聚合物类型以及不同暴露浓度对克雷伯氏菌生长的影响.由图2(a)、(b)可知，LY-5和LY-8聚合物对克雷伯氏菌的生长抑制作用随暴露浓度的增加而增加，导致其初始增长期时间增长，当暴露浓度达到1 000 mg/L时克雷伯氏菌达到对数生长期的时间分别为10 h和8 h(空白对照组为4 h).相比之下，LY-5聚合物对于克雷伯氏菌的抑制作用较LY-8聚合物更为明显.

由图2(c)、(d)可知，当LJL-2聚合物暴露浓度为500 mg/L时对克雷伯氏菌的生长有较为明显的抑制作用，而相同暴露浓度下LJL-3聚合物纯培养的克雷伯氏菌还是具有明显的增长趋势.因此，LJL-2聚合物对于克雷伯氏菌的抑制作用较LJL-3聚合物更为明显且与暴露浓度呈正相关.综合比较乙烯基类及纳米复合涂饰剂和鞣剂系列对于克雷伯氏菌的生长抑制作用发现，前者更为明显.

(a)LY-5暴露下的克雷伯氏菌生长曲线

(b)LY-8暴露下的克雷伯氏菌生长曲线

(c)LJL-2暴露下的克雷伯氏菌生长曲线

(d)LJL-3暴露下的克雷伯氏菌生长曲线图2 不同聚合物类型及暴露水平对克雷伯氏菌纯培养生长的影响

图3为纯培养过程中不同聚合物类型以及不同暴露浓度对芽孢杆菌生长的影响.由图3(a)、(b)可知，不同暴露浓度下LY-5和LY-8聚合物对芽孢杆菌的抑制作用相差不大，暴露浓度为1 000 mg/L下的培养物均在6 h时进入对数生长期.因此，芽孢杆菌对LY-5和LY-8聚合物均具有较高的耐受性.

结合图3(c)、(d)发现，当LJL-2和LJL-3聚合物暴露浓度高于100 mg/L时对芽孢杆菌的生长就出现明显的抑制作用，当暴露浓度为1 000 mg/L时芽孢杆菌虽然可以生长，但迟滞期延长，对数生长期缩短，这在LJL-2暴露下表现更为明显.因此，乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列对于芽孢杆菌的生长抑制作用较乙烯基类及纳米复合鞣剂系列的更为明显.

(a)LY-5暴露下的芽孢杆菌生长曲线

(b)LY-8暴露下的芽孢杆菌生长曲线

(c)LJL-2暴露下的芽孢杆菌生长曲线

(d)LJL-3暴露下的芽孢杆菌生长曲线图3 不同聚合物类型及暴露水平对芽孢杆菌纯培养生长的影响

图4为不同聚合物类型以及不同暴露浓度对克雷伯氏菌和芽孢杆菌混合培养生长的影响.图4(a)为在LY-5聚合物不同暴露浓度下混合培养物的生长变化趋势，暴露浓度为1 000 mg/L时混合培养进入对数生长期的时间为4 h.图4(b)中LY-8聚合物各暴露浓度下的混合培养均在4 h时进入了对数生长期.对比该系列聚合物暴露下纯培养进入对数生长期的时间发现，其对克雷伯氏菌和芽孢杆菌混合培养的抑制作用不明显，甚至较纯培养影响更小，说明共培养体系增加了微生物对污染物的耐毒害作用.

由图4(c)可知，LJL-2聚合物各暴露浓度下混合培养的生长均没有出现明显的进入生长期的时间点.结合对克雷伯氏菌和芽孢杆菌的纯培养研究结果发现，LJL-2聚合物对纯培养和混合培养具有抑制作用.图4(d)中LJL-3聚合物同样对于混合培养生长具有较强的抑制作用，且不利影响表现为剂量依赖行为.综上所述，混合培养体系可以减轻聚合物对微生物的抑制作用，其中乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列对于混合菌的抑制作用较为明显.

(a)LY-5暴露下的混合培养物生长曲线

(b)LY-8暴露下的混合培养物生长曲线

(c)LJL-2暴露下的混合培养物生长曲线

(d)LJL-3暴露下的混合培养物生长曲线图4 不同聚合物类型及暴露水平对混合培养物生长的影响

以上实验结果表明，聚合物类型及不同暴露浓度对不同种群的生长影响有显著差异，乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列聚合物对纯培养和混合培养的抑制均较鞣剂系列聚合物更明显，这可能与乙烯基聚合物结构不同有关.乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列聚合物含有大量的酯基，疏水性较强[20].乙烯基类及纳米复合鞣剂系列聚合物除含有酯基外还有大量的羟基、酰胺基和亲水基团羧基，疏水性较弱，且碳链较长，空间位阻较大[21].因此，具有更高亲脂性的乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列聚合物更容易进入微生物细胞，使得细胞内过氧化水平较高.因此，在皮革化学品的开发过程中不仅要考虑其性能还要考虑引入材料或基团的生态效应，开发绿色皮革化学品.

2.3 乙烯基类聚合物暴露对混合培养物LDH和ROS的影响

LDH是一种广泛用于毒理学和临床化学检测的生物标志物，用于诊断细胞、组织和器官损伤[22],其浓度变化反映了受影响组织的代谢活性变化[23].因此通过测定乙烯基类聚合物暴露处理和对照培养液中的乳酸脱氢酶浓度，可以用于评价乙烯基类聚合物对微生物细胞膜的损伤情况.

由图5可知，不论是纯培养还是混合培养，暴露处理的培养液中的乳酸脱氢酶浓度与对照相比处于同一水平，没有显著差异.说明此类皮革化学品的毒理效应机制不在于细胞膜损伤.

图5 不同聚合物类型及暴露水平对芽孢杆菌和克雷伯氏菌纯培养和混合培养LDH释放率的影响

由图6可知，暴露于乙烯基类聚合物的培养物细胞内活性氧的水平相比于空白对照组均有所提高，说明活性氧胁迫是供试化学品微生物毒理效应的主因.其中增长较大的为LY-5(500 mg/L)、LY-5(1 000 mg/L)、LY-8(1 000 mg/L)、LJL-2(500 mg/L)、LJL-2(1 000 mg/L)、LJL-3(500 mg/L)、LJL-3(1 000 mg/L)，且其大小顺序大致为LJL-3(1 000 mg/L)> LJL-2(1 000 mg/L) > LY-5(1 000 mg/L)> LJL-2(500 mg/L)> LJL-3(500 mg/L)> LY-8(1 000 mg/L)> LY-5(500 mg/L).由此可见，乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列较乙烯基类及纳米复合鞣剂系列的毒性作用更强，两个系列的乙烯基类聚合物的毒性作用均与浓度呈正相关，浓度越高，毒性作用越强.

图6 不同聚合物类型及暴露水平对芽孢杆菌和克雷伯氏菌纯培养和混合培养ROS产率的影响

不同种群对聚合物暴露的活性氧水平响应也有显著差异，如暴露于聚合物LY-5(1 000 mg/L)、LJL-2(500 mg/L、1 000 mg/L)和LJL-3(500 mg/L、1 000 mg/L)的芽孢杆菌纯培养细胞内活性氧水平明显高于克雷伯氏菌纯培养，说明乙烯基类及纳米复合涂饰剂的聚合物对芽孢杆菌的毒理效应较克雷伯氏菌显著.

由暴露于乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列LJL-3(500 mg/L、1 000 mg/L)的芽孢杆菌纯培养和混合培养可知，混合培养下细胞内的ROS水平显著低于纯培养体系.整体上，混合培养体系耐受性更强.低水平的ROS通常是生理上产生的，可以刺激活细胞的一些信号通路[24,25].然而，细胞内过量的ROS会导致许多有害的影响，包括脂质过氧化、DNA修饰和蛋白质氧化，导致细胞损伤[26].混合培养体系在一定程度上可以减轻该类聚合物的毒害作用，这可能是由于采用混合培养策略能为微生物提供在纯培养时无法获得的物质流交换，如为其提供生长必须的氨基酸[27]，使其生长率和降解效率都比纯培养时显著提高[28]，显示活性污泥系统对此类皮革化学品具备一定的生物耐受度和相容性.因此，混合培养体系较之纯培养体系对该类聚合物有更好的耐受性.

3 结论

乙烯基类聚合物的添加并没有对芽孢杆菌和克雷伯氏菌纯培养体系的pH产生影响，但对克雷伯氏菌、芽孢杆菌纯培养和混合培养的抑制作用均呈现剂量-效应关系；乙烯基类及纳米复合涂饰剂系列聚合物较鞣剂系列对克雷伯氏菌和芽孢杆菌纯培养和混合培养的生长抑制更明显；混合培养体系较纯培养体系对聚合物具有更好的耐受性，可以减轻聚合物对其毒理效应；此类化学品的毒理效应机制不在于细胞膜损伤，而在于活性氧的胁迫.本研究表明，此类制革化学品对于活性污泥系统存在潜在毒理效应，应控制排放浓度在100 mg/L下，以减轻对于污水处理系统或者土壤微生物生态的影响.