高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时测定果汁饮品中砷、硒与铬元素的无机形态

吕亚宁，宋 伟，沈贵兰，金玉娟

(1.合肥海关技术中心，安徽 合肥 230022；2.食品安全分析与检测安徽省重点实验室，安徽 合肥 230022)

同种元素的不同形态在植物体内的迁移蓄积规律不同，对人体的危害和在体内的代谢方式也有较大差异，因此重金属元素总量往往很难表征其生物活性和危害。元素的不同化学形态所表现的生物活性、迁移性和毒理影响等有很大差异，例如六价铬比三价铬毒性强，砷、硒等元素的无机形态对人体有害，而其有机形态一般具有一定的功能作用[1-4]。果汁生产在原料种植、加工和储运过程中易受到多种途径的重金属污染，如灌溉用水被污染后造成重金属在果实中富集，加工设备及包装材料中的重金属溶出等，其中砷、铬等是较常见的易污染重金属元素，有必要对其危害性进行分析。另外市场上出现的大量富硒果汁中硒的形态也直接影响产品的安全性和营养价值。因此在果汁的食用安全评价中，对元素形态的分析比总量测定更有意义，但样品基体复杂、形态化合物不稳定且含量较低，使得元素形态的分析比总量测定困难得多。

目前对食品中的元素形态研究多集中于单一元素不同形态的分析[5-11]，对多元素形态同时分析的报道较少。多元素形态同时分析测定能够显著提高分析效率，节约检验成本。但不同元素的形态同时分析难度大，主要是由于：同种元素的不同形态化合物的化学结构相似，其色谱表现相近，色谱分离有难度；不同元素的形态化合物的极性、pK值、离子化程度等有很大差异，增加了色谱分离模式选择的难度。本文利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时分析测定了As、Se、Cr 3种元素的无机形态，利用离子对试剂流动相在C8色谱柱上分离，采用动态反应池技术实现了Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的同时分析，方法的分离度好，检出限低，前处理简单，适用于果汁饮料中As、Se、Cr的无机形态分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(Dlexar，ELAN DRC-e，美国 PerkinElmer公司)；Milli-Q Element 纯水机(美国Millipore 公司)；水浴控温摇床(德国Julabo公司)；。

硒酸根(75.1 μg/g)、亚硒酸根(68.9 μg/g)、砷酸根(0.233 μmol/g)和亚砷酸根(1.011 μmol/g)购自中国计量科学研究院；三价铬、六价铬的单元素储备溶液(均为1 000 mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；四丁基氢氧化铵、乙酸铵、乙二胺四乙酸二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)。

图1 As、Se、Cr元素无机形态标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of As，Se，Cr inorganic species standardconcentration:Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅵ)，As(Ⅴ) and Se(Ⅳ)are 100 μg/L，As(Ⅲ)and Se(Ⅵ) are 50 μg/L

1.2 实验方法

1.2.1样品前处理将果汁样品混合均匀，精确称取 5 g于离心管中，加入20 mL 10%(体积分数)甲醇溶液，超声 10 min，加0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液1 mL，将样液在60 ℃恒温水浴摇床上振荡1 h，10 000 r/min 离心10 min，取上清液用10%甲醇定容至25 mL，取适量过滤后待测，同时做空白实验。

1.2.2仪器条件HPLC条件：Agilent XDB-C8色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；进样体积50 μL；流动相为0.1 mmol/L四丁基氢氧化铵+0.1 mmol/L乙酸铵+10% 甲醇，等度洗脱。

ICP-MS条件：同心雾化器，RF功率1 500 W，载气流速0.75 L/min，泵速20 r/min，反应气流量0.6 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离模式的选择

关于砷、硒等元素的形态分析，文献报道多使用PRP-X100、AS-19等阴离子交换柱进行分离[5-11]，但考虑到多元素形态同时分析时，目标分析物以多种离子状态存在，很难实现同时分离，因此本文尝试采用反相高效液相色谱法。EDTA可以络合Cr(Ⅲ)，络合物在水溶液中呈阴离子状态[12]，而流动相四丁基氢氧化铵在水中形成的正离子TBA+可与各种阴离子形成中性“离子对”，且这些离子对化合物表现出不同的亲脂性，基于C8反相色谱柱对这些化合物保留能力的不同即可实现分离测定。As、Se、Cr元素无机形态标准溶液的色谱图如图1所示。

为保证较好的分离度，本实验选择在样液处理时加入EDTA溶液，而不添加至流动相中，原因是当EDTA添加到流动相时会增加离子强度，从而降低分析物的保留[12]，导致Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的峰形变差。在相同色谱条件下，参考文献[12]，对比了添加EDTA前后，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)响应值的变化，结果表明EDTA的添加对其他被分析物基本无影响。

2.2 流动相对色谱分离的影响

图2 pH 7.2条件下3种元素形态化合物标液的色谱图Fig.2 Chromatograms of three element species standard solution under pH 7.2

离子对色谱中，柱有效容量取决于离子对试剂，离子对试剂浓度越大，被分析物的保留越强，因此实验考察了流动相pH 7.2，离子对试剂四丁基氢氧化铵(TBAOH)浓度分别为0.05、0.1、0.2 mmol/L时的出峰情况。结果发现，当TBAOH浓度为0.2 mmol/L时，被分析物的分离度良好，但分析时间过长；当浓度为0.05 mmol/L时，被分析物的保留时间太短，且分离度差；而当浓度为0.1 mmol/L时，被分析物的保留时间为1.22～1.65 min，且分离度能满足要求，最终确定TBAOH的最佳浓度为0.1 mmol/L。

有机试剂可降低流动相的极性，影响分析物与离子对试剂所形成的复合物在疏水环境的分配，并能减少柱有效容量；但在高效液相色谱仪与电感耦合等离子体质谱仪联用时，较高浓度的有机溶剂会造成积碳严重和等离子体熄火，因此本实验将甲醇体积分数控制在10%以内，设定流动相pH 7.2，TBAOH浓度为0.1 mmol/L时，考察了甲醇体积分数分别为5%、10%时分析物的保留情况。结果表明：随着甲醇体积分数的增加，各分析物的保留时间明显缩短，主要是因为甲醇能够阻碍分析物与离子对试剂结合，从而影响其在C8柱上的保留。考虑到分离度与分析时间，选择最佳流动相为0.1 mmol/L四丁基氢氧化铵+0.1 mmol/L乙酸铵+10%甲醇，该条件下各分析物均可在1～3 min内出峰，且分离度满足要求。

2.3 电感耦合等离子体质谱测量条件

普通模式下，选择丰度最高的硒同位素80Se及52Cr对目标元素进行测定，基线响应值达105cps数量级，无法进行正常分析，这主要是因为80Se、52Cr、75As分别会受到40Ar2+、40Ar12C+和40Ar35Cl等多聚离子的干扰。为消除它们的影响，本研究采用甲烷作为反应气的动态反应池DRC模式，优化了气体流速和RPq值。优化实验中分别对空白溶液和标准溶液进行分析，选择背景等效浓度为10 μg/L 时为最优条件，优化后得到监测离子分别为52Cr+、78Se+、75As+，反应气流量0.6 mL/min，RPq为0.45。

2.4 线性范围与检出限

将6种形态化合物配成含Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的混合标准溶液，其质量浓度范围分别为5～100、5～100、2～100、2～100、20～100、20～100 μg/L。在最佳的仪器条件下进行测定，以各元素形态的质量浓度(x，μg/L)为横坐标，对应峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，目标分析物在上述相应的质量浓度范围内具有较好的线性关系，相关系数均大于0.995。以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限，Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的检出限分别为0.34、0.20、0.50、0.40、0.82、0.90 μg/L。以S/N=10计算得到定量下限分别为0.006、0.003、0.009、0.007、0.014、0.015 mg/kg。

2.5 实际样品分析

为验证本方法的实际应用能力，对不同的果汁样品进行测定。结果表明，苹果汁未检出该6种形态；蓝莓汁检出Cr(Ⅲ)和Se(Ⅳ)，含量分别为0.007、0.015 mg/kg；杂粮汁检出Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)和Se(Ⅳ)3种形态，含量为0.008～0.034 mg/kg。为考察该方法的准确性，对3种果汁样品进行加标回收实验，几种元素无机形态的加标回收率为79.5%～112%，相对标准偏差(RSD)小于5.0%，结果见表1。GB 2762-2017对果蔬、谷物等食品中总砷、无机砷、总铬的限量在0.2～1.0 mg/kg之间，根据料液比折算，各检测值均低于限量要求。

表1 3种果汁样品的分析结果Table 1 Analytical result of three kinds of fruit juice samples

*no detected

3 结 论

本文建立了同时分析果汁饮料中Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的离子对色谱-电感耦合等离子体质谱法，以0.1 mmol/L四丁基氢氧化铵、0.1 mmol/L乙酸铵和10%甲醇为流动相，并调整pH值至7.2，利用C8色谱柱对该6种无机形态化合物进行分离，解决了离子色谱中不同元素形态因离子状态不同而无法同时分析的问题。方法检出限为0.20～0.90 μg/L，RSD均小于5.0%，实际样品分析显示富硒蓝莓汁中有微量的Cr(Ⅲ)和Se(Ⅳ)检出，杂粮汁有Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)和Se(Ⅳ)检出，各无机形态含量水平低无风险。该方法回收率高、操作简单、灵敏度高，可为元素形态分析提供借鉴。