QuEChERS/LC-MS/MS法测定食品中7种真菌毒素

熊 欣，刘 青，张广文，庞世琦，曾广丰，陈文锐

(1.暨南大学 理工学院，广东 广州 510632；2.广东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，广东 广州 510623；3.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623)

真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，在食品生产、储存、加工和流通环节均可能因保存条件不当而造成真菌毒素污染[1]，其中黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)和赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是常见的两类真菌毒素。这两类毒素均具有致癌、致畸和神经毒性作用[2-3]。黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性作用靶器官主要是肝脏，会造成严重的肝损伤或诱发肝癌，甚至致死[4]。赭曲霉毒素A(OTA)主要危及人和动物肾脏，会对肾脏造成损害，还可导致神经中毒[5]。AFB1和OTA分别被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)定义为Group 1B类和Group 2B类致癌物[6]。我国《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2017)[7]中规定了食品中允许的真菌毒素最高限量，其中AFB1在谷物中的限量为5.0 μg/kg，在花生及其制品中为20.0 μg/kg，OTA在谷物中为5.0 μg/kg。

食品中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素的检测方法主要有荧光检测法[8-9]、酶联免疫吸附法[10]、液相色谱法[11]、液相色谱-质谱法[12-14]等。由于食品成分复杂，目前较为常用的净化富集方法有固相萃取柱净化法[15]与免疫亲和柱净化法[16-17]。这两种方法回收率高、重复性好，但分析成本高，不适于大批量样品检测。QuEChERS是由美国化学家Lehotay和德国的Anastassiadas[18]在固相萃取基础上提出的新技术，因具有快速、简便、经济等特点在农兽药残留检测领域得到广泛应用[19-20]。近年来，开始逐渐应用于真菌毒素检测[21-23]。目前国内对赭曲霉毒素的检测研究主要集中于OTA的测定，对赭曲霉毒素B(OTB)的研究相对较少，尚无对赭曲霉毒素C(OTC)的相关研究报道。OTC是OTA的前体物，OTB则是OTA的脱氯衍生物。OTC和OTA的毒性相当，OTB相对较弱。在酒精或酸性环境下，OTA羟基酸转化成乙醇酯OTC，通过口服和注射，OTC能够迅速水解成OTA[24]，表现出OTA和OTC之间的协同毒性作用。由于同一种真菌几种代谢产物的共同出现可能会对人体或动物的健康产生更复杂的影响，甚至表现出对人体的协同毒性作用。因此在自然条件下，混合了几种真菌代谢产物的食品污染是必须要考虑的。

本文分别对大米、饼干、花生油等5种代表性食品基质中AFB1、AFB2(黄曲霉毒素B2)、AFG1(黄曲霉毒素G1)、AFG2(黄曲霉毒素G2)、OTA、OTB和OTC 7种真菌毒素的前处理方法和检测条件进行优化，建立了QuEChERS净化技术结合高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时检测上述7种真菌毒素的方法，其中对OTC的检测为国内首次报道。该方法灵敏度高、重现性好，降低了检测成本，提高了检测效率，能满足实际工作中大批量样品的检测需求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RM S.3振荡器、VORTEX4涡旋混匀器(德国IKA公司)；3-16PK冷冻离心机(美国Sigma公司)；API3500 QTrap 高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)； Turbo Vap LV 吹氮浓缩仪(瑞典Biotage公司)； SW30h超声波清洗仪(瑞士Sono Swiss公司)。

黄曲霉毒素总量标准品(5 mg/L，B1∶B2∶G1∶G2= 4∶1∶4∶1，美国Trilogy公司)；赭曲霉毒素A(OTA)标准品(10 mg/L，美国Trilogy公司)；赭曲霉毒素B(OTB)标准品(10 mg/L，美国Romer Labs公司)；赭曲霉毒素C(OTC)标准品(10 mg/L，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；乙腈(色谱纯)、乙酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、乙酸铵、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸氢二钠倍半水合物、无水硫酸镁、C18dSPE分散剂、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、中性氧化铝(Al-N)、石墨化炭黑(GCB)、弗罗里硅土、氨基硅胶(NH2)，均购于德国CNW Technology公司；氯化钠、二氧化硅、甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)；实验用水符合 GB/T 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》中一级水的规定。淀粉类食品、焙烤类食品及花生制品基质的样品，均为通过超市购买、日常法定委托等收集到的样品。

1.2 标准溶液的配制

将7种毒素标准样品用甲醇配成1 000 μg/L的混合标准储备液，置于4 ℃冰箱内保存。实验时现配成工作标准液(黄曲霉毒素总量:2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、125.0 μg/L；赭曲霉毒素A、B、C:1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0 μg/L)。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)色谱柱；柱温:35 ℃；流速:0.4 mL/min；进样量:10 μL；流动相:A为0.1%甲酸，B为乙腈；梯度洗脱条件:0～4.0 min，50% A；4.0～4.1 min，50%～15% A;4.1～12.0 min，15% A。

1.3.2质谱条件离子源:电喷雾离子源(ESI)；扫描方式:正离子扫描，MRM模式；毛细管电压5.5 kV；离子源温度550 ℃。

1.4 样品前处理方法

精确称取4 g(精确至0.01 g)粉碎样品于50 mL离心管中，加入10 mL水，振荡1 min。加入10 mL 甲酸-乙腈(10∶90，体积比)，超声10 min。加入6.5 g盐析剂(无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠二水合物和柠檬酸氢二钠倍半水合物，质量比为4∶1∶1∶0.5)，立即手摇1 min，4 500 r/min离心10 min。用乙腈将有机相定容至10 mL。取8 mL上清液于15 mL离心管中(含净化剂:1.2 g MgSO4+0.25 g C18+0.25 mg Al-N+0.4 g PSA)，手摇1 min，4 500 r/min离心5 min。

取5 mL上清液至玻璃管中(花生制品取2.5 mL)，40 ℃氮吹至干。加入1 mL 0.1%甲酸-乙腈(1∶1，体积比)复溶，涡旋1 min。过有机滤膜后待进样分析。

图1 不同提取剂对7种真菌毒素提取效率的影响(加标10 μg/kg，n=3)Fig.1 Effect of different extracting solvents on recoveries of 7 mycotoxins at spiking level of 10 μg/kg(n=3)A:acetic acid-MeCN(1∶99)；B:acetic acid-MeCN(5∶95)；C:acetic acid-MeCN(10∶90)；D:formic acid-MeCN(1∶99)；E:formic acid-MeCN(5∶95)；F:formic acid-MeCN(10∶90)

图2 7种真菌毒素在不同净化剂组合下的回收率(加标10 μg/kg，n=3)Fig.2 Recoveries of different sorbents for d-SPE clean-up of 7 mycotoxins at spiking level 10 μg/kg(n=3)A:0.4 g Al-N+0.25 g C18+1.2 g MgSO4；B:0.4 g PSA+0.25 g C18+1.2 g MgSO4；C:0.25 g Al-N + 0.4 g PSA+0.25 g C18+1.2 g MgSO4

2 结果与讨论

2.1 QuEChERS前处理方法优化

2.1.1提取剂的优化赭曲霉毒素和黄曲霉毒素多使用乙腈(MeCN)为提取剂，同时加入一定量的酸进行酸化提取[25-27]。本文选取空白大米样品，加标量为10 μg/kg，采用超声提取方式，分别考察了不同体积比的甲酸-乙腈(1∶99、5∶95、10∶90)和乙酸-乙腈(1∶99、5∶95、10∶90)对目标物的提取效果(见图1)。结果显示，乙酸-乙腈体系对OTA和OTB的提取效率较差，两者的回收率均在30%以下，甲酸-乙腈体系对7种真菌毒素有较好的回收率。综合考虑，最终选择甲酸-乙腈(10∶90)作为提取剂。

2.1.2提取方式的选择以加标量为10 μg/kg的空白大米样品为对象，考察了振荡和超声两种提取方式和不同提取时间对目标物加标回收率的影响。比较了振荡30 min、1 h，超声提取10 min、20 min共4种提取方式。结果表明，4种提取方式对7种目标毒素均具有较好的加标回收率，提取效果无明显区别。考虑时间成本，最后选择超声提取10 min。

2.1.3吸附净化剂的优化QuEChERS前处理中常用的吸附净化剂有PSA、GCB、C18、Al-N、NH2、弗罗里硅土和SiO2[19-23，28-29]。本实验将加标量为10 μg/kg的空白大米样品超声提取10 min后，考察了上述常用净化剂与MgSO4组合对样品的净化效果。结果表明:使用C18、Al-N、PSA作为吸附净化剂的效果较好。

进一步对不同的净化剂组合和用量进行优化(图2)，结果表明，净化剂组合A(0.4 g Al-N+0.25 g C18+1.2 g MgSO4)对AFB1和AFG1的吸附作用很强，导致AFB1和AFG1的回收率偏低。而另外两组净化剂组合对7种真菌毒素均有良好的净化效果和回收率。综合考虑净化效果和回收率，最终选择组合C(1.2 g MgSO4+0.25 g C18+0.4 g PSA+0.25 g Al-N)为最佳吸附净化剂。

2.2 色谱-质谱条件的优化

2.2.1色谱条件的选择考察了0.1%乙酸-10 mmol/L乙酸铵-乙腈和0.1%甲酸-乙腈两种流动相的分离效果，发现以后者为流动相时得到的基线平稳，分离效果好，响应值高。因此，选择0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱，提取离子流色谱图见图3。

2.2.2质谱条件的确定对30 μg/L的混合标准溶液，以选定的质量数范围(m/z100～800)进行一级质谱全扫描，得到目标物的母离子精确质量数，再对其进行二级质谱扫描，并优化质谱参数。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数。7种化合物的母离子精确质量数、保留时间，碎片离子的精确质量数以及去簇电压和锥孔电压参数见表1。

表1 MRM模式质谱分析参数Table 1 Parameters of mass spectrometry analysis in multiple-reaction monitoring(MRM) mode

*quantitation ion

表2 LC-MS/MS检测7种真菌毒素的线性范围、线性方程及相关系数Table 2 Linear range,calibration equations，correlation coefficients(r) of seven mycotoxins by LC-MS/MS

2.3 线性范围与相关系数

按“1.2”用甲醇逐级稀释配制不同质量浓度的7种毒素系列混合标准溶液，进行LC-MS/MS测定。以质量浓度(X，μg/L)为横坐标，响应值的峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准工作曲线。各化合物的线性范围、线性方程和相关系数见表2。7种真菌毒素线性良好,相关系数(r)均不小于0.999。

2.4 方法定量下限、精密度与准确度

选取大米、饼干、曲奇、花生油、花生酱5种食品基质，用空白基质进行加标回收实验，将回收率符合要求的最低加标浓度作为方法的定量下限(LOQ)。在空白样品中分别添加0.25～40 μg/kg范围的3个水平的混合标准溶液，按上述步骤处理，每个水平平行实验6次，采用外标法定量，回收率和相对标准偏差(RSD)结果见表3。以加标回收率满足要求的最低加标量为方法的定量下限，本方法的定量下限为0.25～5.0 μg/kg，平均回收率为71.5%～119%，RSD为1.1%～7.7%。

表3 7种真菌毒素的平均回收率、相对标准偏差(n=6)及定量下限Table 3 Average recoveries，relative standard deviations(RSDs，n=6) and limits of quantitation(LOQs) of 7 mycotoxins

(续表3)

SubstrateMycotoxinSpiked(μg·kg-1)Recovery/%RSD/%LOQ(μg·kg-1)AFG11,5,1093.1,90.0,86.55.7,4.9,4.61.0AFG20.25,1.25,2.5096.0,92.1,96.77.0,4.5,5.20.25BiscuitsOTA2,5,1090.5,94.2,86.25.8,5.2,3.12.0OTB2,5,1090.6,94.3,96.05.1,4.9,4.92.0OTC2,5,1093.7,91.4,96.06.4,5.8,2.72.0AFB11,5,1094.0,107,1027.0,5.5,4.01.0AFB20.25,1.25,2.5072.3,79.3,74.44.3,4.8,3.20.25AFG11,5,1079.9,87.3,91.15.2,5.2,3.51.0AFG20.25,1.25,2.5090.6,88.6,86.26.2,6.0,4.10.25CookiesOTA2,5,1094.9,93.0,90.52.4,3.7,2.82.0OTB2,5,1087.2,73.7,1195.8,6.8,3.52.0OTC2,5,1086.6,85.1,1017.4,6.9,4.12.0AFB11,5,10116,91.3,1196.2,4.3,2.41.0AFB20.25,1.25,2.5081.1,113,1093.1,5.4,4.90.25AFG11,5,1088.6,97.0,98.12.5,2.0,1.11.0AFG20.25,1.25,2.5086.2,96.2,94.06.2,5.8,5.20.25PeanutoilOTA2,5,1098.1,103,1192.3,1.3,3.72.0OTB2,5,10104,103,92.53.1,2.9,2.72.0OTC2,5,1081.6,78.0,80.04.4,3.3,3.02.0AFB15,20,4089.6,117,1043.2,3.7,4.15.0AFB21.25,5,1081.7,79.5,1025.2,4.8,4.61.25AFG15,20,4090.5,116,1073.6,4.4,3.75.0AFG21.25,5,1092.1,102,88.66.1,5.7,5.01.25Peanut butterOTA2,5,1086.8,81.7,82.76.2,5.6,5.72.0OTB2,5,1083.5,85.4,86.95.1,5.9,4.82.0OTC2,5,1075.2,72.4,74.77.1,7.7,5.72.0AFB15,20,4081.8,88.9,89.74.0,5.7,5.65.0AFB21.25,5,1073.4,78.0,75.65.7,6.4,4.41.25AFG15,20,4083.6,86.4,83.66.0,5.7,6.35.0AFG21.25,5,1077.7,71.5,73.27.6,6.9,4.21.25

2.5 与现有国家标准比较

我国食品安全国家标准GB 5009.22 和GB 5009.96[30-31]中，分别规定了食品中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素的检测方法，且采用液相色谱和液相色谱-质谱检测时，样品的净化主要使用免疫亲和柱法和离子交换固相萃取柱法。本方法对4种黄曲霉毒素的定量下限均高于国标方法，但均低于食品安全标准GB 2761中黄曲霉毒素的限量要求；OTA的定量下限为2.0 μg/kg，低于国标方法中OTA的定量下限3.0 μg/kg，且国标方法中未涉及OTB、OTC的检测。相比于国标，本方法快速、简便、成本低，更适用于日常检测中大批量样品的筛查。

2.6 实际样品的筛查

采用本方法对大米、大米制品、花生制品、烘焙食品等15个样品中的上述7种真菌毒素进行筛查。结果表明，1款购自农贸市场的花生油样品检出黄曲霉毒素，AFB1和AFB2检出量分别为11.18 μg/kg和1.95 μg/kg，均低于国家限量标准要求。其余样品均未检出上述真菌毒素。

3 结 论

本研究建立了QuEChERS前处理结合高效液相色谱-串联质谱联用检测AFB1等7种真菌毒素的方法。建立的QuEChERS前处理方法适用于多种类型的食品基质，对目标物有良好的净化提取效果；检测方法快速灵敏，重现性好，精密度高，能满足大批量食品样品中7种真菌毒素残余量的检测要求。由于我国目前尚未建立OTB、OTC相关限量标准，鉴于这两种毒素存在一定的毒性累积风险，本方法为OTB与OTC的监测提供了技术依据。