高产二十碳五烯酸的微拟球藻藻株的诱变选育

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(1.青岛琅琊台集团股份有限公司,山东 青岛 266400;2.中国科学院 青岛生物能源与过程研究所,山东 青岛 266101;3.黄岛出入境检验检验局,山东 青岛 266400;4.青岛市黄岛区食品药品监督管理局,山东 青岛 266400)

二十碳五烯酸(C20∶5,n-3,EPA),是一种ω-3多不饱和脂肪酸,具有广泛的生物活性,同时也是一些人体组织细胞膜的重要组成部分,具有重要的生理功能,已经证实增加EPA的吸收对治疗冠状动脉心脏病、高血压有效[1].长期以来,EPA主要来源于鱼油,但由于渔业资源的减少以及环境问题的日益突出,人们开始寻找EPA的替代来源.由于微拟球藻(Nannochloropsissp.)可在很短的生长周期内积累大量的EPA,越来越受到关注,被认为是最有潜力的EPA的生产者[2-3].尽管如此,低产量和高成本仍然是微拟球藻大规模生产EPA的瓶颈.目前,诱变法是获得高产菌株的有效方法之一.一般而言,诱变方法可分为物理诱变和化学诱变两大类[4].重离子诱变是一种新的物理诱变技术,与传统的诱变源(主要为γ射线和X射线)相比,重离子辐射具有独特的优势[5-6],如:1) 传能线密度(Linear energy transfer, LET)高,使生物介质产生高密度的电离和激发事件,从而容易产生突变体;2) 可使得生物样品局部受损,这种局部受损的位置可随离子能量的高低而变化,是可控的,可实现定位诱变、定向育种;3) 对生物体产生的总体生理损伤相对较小,且损伤后修复效应小,可产生大量的稳定的突变体;4) 相对生物效应(Relative biological effectiveness, RBE)大,因此对生物诱变作用强、诱发突变谱广、突变率高.快速识别和筛选高产突变体也是育种研究的重要课题.定向筛选比随机选择更有效,可以减少工作量.脂肪酸合酶(FAS)是微拟球藻合成EPA的关键酶之一,增强脂肪酸合酶的活性有可能提高EPA的产量.三氯生具有广谱抗菌作用,可通过抑制fabI基因位点抑制FAS的活性[7].通常在一定浓度的三氯生培养基上生长的突变体可以被鉴定为具有相对较高的FAS活性,使它们成为脂质生产的良好候选.

在本研究中,首先采用重离子束辐照对微拟球藻野生藻株进行诱变,随后,利用三氯生对突变体进行定向筛选,取代了之前的随机选择方法,大大提高了筛选效率.

1 材料与方法

1.1 藻种与培养条件

本实验藻种来源于中国科学院青岛生物能源与过程研究所的藻株库,藻株为微拟球藻NannochloropsisoceanicaSD595.培养基为BG-11海水培养基:NaNO31.5 g/L,K2HPO4400 mg/L,MgSO4·7H2O 375 mg/L,CaCl2·2H2O 180 mg/L,Na2CO3100 mg/L,柠檬酸30 mg/L,柠檬酸铁铵24 mg/L,海水晶15 g/L,ZnSO4·7H2O 0.222 mg/L,CuSO4·5H2O 0.079 mg/L,MnCl2·4H2O 1.81 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.39 mg/L,Co(NO3)4·6H2O 0.0494 mg/L,H3BO32.86 mg/L,Na2EDTA 5 mg/L.培养温度25 ℃,光强为150 μmol/(m2·s).

1.2 重离子束辐照和三氯生联合筛选

为了获得稳定、高产的EPA藻株,整个实验包括四步筛选程序.详细的过程如下所述：

第一步,制备细胞悬浮液.首先将SD595藻株预培养48 h使其细胞数量达到106～107个/mL,取10 mL微藻培养液,在离心力8 000g条件下离心10 min,弃去上清,在同样条件下用去离子水清洗1 次后,用10 mL 0.9%的生理盐水重悬混匀待用.

第二步,在中国科学院现代物理研究所的兰州重离子加速器国家实验室进行了重离子光束辐照实验.辐照条件为12C6+重离子束,能量为80 MeV/μ,辐照剂量为40,80,120,160,200 Gy.辐照后悬浮液稀释至3份,取100 μL悬浮液涂在BG11固体平板培养基上.在25 ℃条件下,黑暗中孵育4 d,计算死亡率,确定最佳辐照剂量(致死率在70%左右).死亡率=(对照组平板菌落数-辐照组平板菌落数)÷对照组平板菌落数×100%.

第三步,确定最佳抗菌剂三氯生的质量浓度.分别取100 μL待用的微拟球藻悬浮液涂布于含有不同三氯生质量浓度(0,0.1,0.5,0.6,0.8,1.0,1.5,2,2.5,3 mg/L)的BG11平板培养基上,25 ℃孵育4 d,分别计算死亡率,确定最佳三氯生质量浓度.

第四步,将经过最佳辐照条件下辐照的微藻培养液100 μL涂布于含有最佳三氯生浓度的平板上.25 ℃孵育4 d后,选取突变体测试其生长特性及EPA的产量.

1.3 生物量的测定

培养物经8 000g离心10 min后,弃上清,加入等体积去离子水洗涤1次,-40 ℃真空冷冻干燥48 h,称其干质量[8].生物量=干质量÷培养物体积.

1.4 油脂的提取

称取100 mg的藻粉,加入600 μL 6 mol/L盐酸,振荡混匀,沸水浴煮5 min,-20 ℃速冷后加入900 μLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶剂,5 000g离心5 min,取氯仿层,加600 μL质量分数为0.1%的氯化钠溶液,混匀,5 000g离心5 min,取氯仿层移至干燥的试管中,挥发除去氯仿,得到油脂,然后50 ℃真空干燥至恒重,称量[9].含油率=油脂质量÷藻粉质量×100%.

1.5 油脂中EPA含量的测定

将提取的油脂溶解于1 mL氯仿中,加入2.5 mL质量分数为2%的硫酸-甲醇溶液,85 ℃水浴加热2.5 h,冷却至室温,加入1 mL正己烷和1 mL饱和氯化钠溶液,混匀,静置分层后取上层,经0.22 μm尼龙膜过滤后,进行气相色谱检测[10].色谱条件:Agilent GC-6890型气相色谱仪,色谱柱HP-INNOWax(30 m×250 μm×0.25 μm,安捷伦公司).采用程序升温,初始温度100 ℃,按15 ℃/min升到240 ℃,保持10 min;进样口温度250 ℃;FID检测器,检测器温度260 ℃[11].

2 实验结果

2.1 最佳辐照剂量的确定

重离子诱变已经成功地应用于植物[12]和一些工业微生物诱变育种项目[13-14].由于缺乏微拟球藻重离子诱变的参考条件,本实验研究了5种辐照剂量的致死率,如图1所示.在40,80,120,160,200 Gy时,死亡率分别为45%,77%,89%,95%和99%.随着剂量的增加,细胞的致死率增加,在80 Gy时急剧增加到77%.一般而言,致死率为70%～80%时,会产生较高的阳性突变率[6].因此,在本研究中,重离子束辐照诱变在80 Gy剂量下进行.

图1 不同辐照剂量对微拟球藻的致死效果Fig.1 The lethal effects of different irradiation doses on Nannochloropsis

2.2 最佳三氯生筛选质量浓度的确定

三氯生可抑制脂肪酸合成过程中fabI基因位点,而能在含有三氯生的培养基中生长的菌落被认为具有较强的脂肪酸合成活性[7].Cheng等的工作证明:突变株在含有三氯生的培养基上生长时,其致死率达到90%左右时,存活的突变株将有较大几率具有较强的脂肪酸合成活性[15].因此,为了确定野生型藻株对三氯生的敏感性,笔者将微拟球藻SD 595分别涂布到含有不同三氯生质量浓度的平板上.结果发现三氯生能抑制SD 595藻株的生长,随着三氯生质量浓度的增加,藻落数减少.当三氯生质量浓度为2 mg/L时,致死率约为93%(图2).因此,在重离子束辐照诱变后,选择2 mg/L的三氯生作为筛选突变体的合适质量浓度.

图2 三氯生对微拟球藻的致死效果Fig.2 The lethal effect of triclosan on Nannochloropsis

2.3 高产EPA的微拟球藻突变株的筛选

将经过辐照剂量为80 Gy的重离子束处理的细胞液梯度稀释,涂布到含有质量浓度为2 mg/L的三氯生的BG11培养基平板中,25 ℃孵育4 d.Cheng等的研究证明:只有高脂肪酸合酶(FAS)活性的突变株可以成长,形成较大的菌落[15].随机选取了150个大的菌落,在含有质量浓度为2 mg/L的三氯生的平板上进行了3次复筛，53个突变体仍然能够稳定地生长.进一步筛选出19株具有高脂质和EPA含量的藻株，如图3所示.突变M44的EPA产量最高,脂质和EPA质量分数分别为42.9%和43.3%,分别比出发藻株SD 595提高39.3%和48.3%.脂肪酸组成分析(表1)发现:突变M44的EPA质量分数显著提高,从29.2%到43.3%;C16∶0,C16∶1和C18∶1的比例显著下降.

1—SD595;2—M5;3—M6;4—M9;5—M12;6—M13;7—M18;8—M21;9—M22;10—M24;11—M27;12—M30;13—M33;14—M34;15—M36;16—M42;17—M43;18—M44;19—M46图3 株高产藻株与出发藻株SD595油脂和EPA质量分数的比较Fig.3 Comparison of the lipid and EPA contents between SD595 and 19 mutants

表1 突变藻株M44与出发藻株SD595的脂肪酸组成比较 Table 1 Comparison of the fatty acid composition between strain M44 and SD595

2.4 遗传稳定性检测

将藻株M44在BG11培养基上连续传代培养10次,每5代测定其生物量、油脂和EPA产量.如表2所示,在传代10次后EPA质量浓度大约维持在2.5 g/L左右,生物量稳定在13 g/L左右,经统计学分析,M44菌株第1代与第5代及第10代间EPA产量没有显著性差异,表明突变藻株M44具有良好的遗传稳定性.

3 结 论

相比与传统的物理诱变(如紫外线、γ和X射线),重离子束辐照诱变具有更高的传能线密度,能引起更多的生物损伤且难以修复,造成的突变相对稳定[16].如何有效地从大量突变体中筛选出高产菌株是诱变育种中的关键问题[17].当添加三氯生作为筛选压力进行定向选育高效脂肪酸合成菌株时,能大大提高正突变株的筛选效率.从实验结果来看,使用三氯生筛选法后,所有53种突变体中筛选的19株突变藻株的EPA质量分数至少增加了30%,阳性突变率为38%,大大提高了工作效率.综上所述,采用重离子束辐照联合三氯生处理的方法定向筛选高产EPA的微拟球藻藻株,是一种有效的育种方法.

表2 突变藻株M44遗传稳定性考察Table 2 Genetic stability of mutant M44