血清Semaphorin3A的水平与绝经后骨质疏松妇女的骨密度和骨转换指标关系的研究

郭君红 宋晓婕 周洁琼 刘丽平 聂华 田萍 徐亮

1华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）（武汉 430015）；2长江航运总医院武汉脑科医院（武汉430000）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一多因素病因引起的慢性进展性疾病，以骨量低下、骨微结构破坏和骨强度下降导致骨脆性增加、易发生骨折为特征，其严重并发症为骨折[1]，从而影响患者的身心健康及带来经济负担，是一较常见的骨代谢疾病。其中绝经后骨质疏松症（postmenopausal os⁃teoporosis，PMOP）属原发性高代谢转换型OP，好发于绝经后的中老年妇女，主要因同时存在雌激素缺乏、持续的钙丢失和骨老化等多因素，骨代谢在绝经前后的时间开始快速丢失，骨吸收量明显高于骨形成量，致使骨量逐渐丢失、骨密度随之下降，进而发生高转换型的绝经后骨质疏松症[2]，最后导致骨折风险相应增加。据统计，全球60～70岁女性1/3以上患有骨质疏松，50岁以上女性有1/3因骨质疏松而骨折[3]。预防和认识骨质疏松是减少此种情况影响的一线措施[4]。

健康成人体内，成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收维持着正常的骨代谢稳态，骨组织通过不断地重塑来保持骨的完整性及矿物质的内稳定，骨骼的自我稳态是在内分泌系统、免疫及神经系统的多种途径的调控下实现的[5]。骨形成与骨再吸收之间的不平衡可导致骨质疏松症等骨代谢疾病[6]。

Semaphorins家族近年来广受关注，具有重要免疫调控作用的神经轴突导向因子，最初由KOLODKIN等[7]在20世纪90年代中发现。日本学者 TAKAYANAGI等[8]研究发现该家族成员 sema⁃phorin3A（Sema3A）可以通过抑制破骨细胞的骨重吸收和增加成骨细胞的骨形成来发挥双向调节的骨保护作用，其实验发现semaphorin⁃3A缺陷小鼠除了会呈现一种骨质破坏的表型，也会表现出骨合成调节因子和成骨细胞数量的减少，而静脉注射semaphorin⁃3A可以预防卵巢切除引起的骨丢失。

目前研究人体内血清Sema3A的水平与绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）妇女的关系的研究尚少。LIU等[9]研究证实PMOP妇女的血清sema3A水平与骨形成标志物骨钙素（osteocalcin，OC）呈正相关（r＝ 0.077，P＝0.025），从而支持sema3A在小鼠研究中的骨保护作用。而Sema3A水平与骨形成标志物I型前胶原氨基端前肽（procollagen type I amino⁃ter⁃minalpropeptide，PINP）的关系研究尚未见报道，本实验旨在研究PMOP妇女血清Sema3A的水平与BMD、骨形成标志物PINP、骨吸收标志物I型胶原交联C⁃末端肽（C⁃terminal crosslinking of type I collagen，CTX）的相关性，以进一步丰富临床数据库，为抗骨质疏松药物的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 病例及标本收集2017年1月至2017年12月在本院门诊就诊的85例PMOP妇女，其绝经期在2年以上10年以下，详细询问既往疾病史，排除以下情况：（1）糖尿病、甲亢、恶性肿瘤等影响骨代谢的其他内分泌疾病或慢性疾病；（2）受检前（半年内）使用影响骨代谢的药物如大剂量钙剂、雌激素、雄激素、二磷酸盐、皮质激素等；（3）近3月内采用激素替代治疗；（4）既往放疗；（5）异常的肝肾功能检测。同期收集在本院体检健康的90例绝经后妇女作为对照组，6个月内未使用过免疫增强或抑制剂，研究前所有受试者均签署知情同意书。受试者于上午7：30～9：30之间采集空腹静脉血，分装入不含抗凝剂的离心试管中并静置，在1 h内以2 000 r/min离心，所得血清置于-80℃冰箱冷冻保存待检。

1.2 方法

1.2.1 骨密度测定采用美国Hologic⁃QDR⁃4 500 W双能X线骨密度仪（dual⁃energy X⁃ray ab⁃sorptiometry，DEXA）进行骨密度的测量，测定部位为腰椎（L2⁃4）前后位，每日测前均行体模测试，测量的变异系数（cv）＜1%。OP诊断标准：参照国人OP的诊断标准[10]，骨密度低于峰值骨量的2倍标准差以上为骨质疏松，骨密度大于峰值骨量的1倍标准差为骨质正常。

1.2.2 血清Sema3A的测定采用Santa Cruz公司的酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immunosor⁃bent assay，ELISA）试剂盒测定，最终反应板在DYNA TECH⁃MR500型酶标测定仪于450nm处读取吸光度（A）值。每例血清样本皆设正、副2个测试孔，取其平均A值。所测值按标准曲线换算成Sema3A含量。

1.2.3 血清I型前胶原氨基端前肽（procollagen type I amino⁃terminalpropeptide，PINP）、血清I型胶原交联C⁃末端肽（C⁃terminal crosslinking of type I collagen，CTX）的测定采用罗氏自动电化学发光系统检测，试剂由罗氏公司提供，PINP、CTX的批 内变异系数（CV）分别为4.6%、4.0%，PINP、CTX的批间CV均＜6.0%。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以均值±标准差表示，组间均数比较用t检验；参数间的相互关系用直线相关分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 绝经后骨质疏松组患者与对照组的基本特征描述两组研究人群的一般资料及测量指标见表1。绝经后骨质疏松组和对照组的年龄、绝经年限、身高、体重、BMI无明显差异（均P＞0.05）。绝经后骨质疏松组的腰椎BMD（0.845±0.079）g/cm2明显低于对照组（1.149±0.069）g/cm2，P＜0.01。绝经后骨质疏松组的血清CTX（0.524±0.026）ng/mL、PINP（54.64± 8.79）ng/mL水平均明显高于对照组（0.413±0.025）ng/mL和（45.13±9.16）ng/mL，均P＜0.01。绝经后骨质疏松组的Sema3A（4.20±0.59）ng/mL明显低于对照组（6.89±1.06）ng/mL，P＜0.01。绝经后骨质疏松组与对照组血清钙、血清磷比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 腰椎BMD与血清CTX、PINP的相关性直线相关分析显示：绝经后骨质疏松组的腰椎BMD与血清CTX、PINP均呈负相关（分别r＝-0.513，r＝-0.236，均P＜ 0.05），对照组的腰椎BMD与血清CTX、PINP亦均呈负相关（分别r＝-0.484，r＝-0.210，均P＜ 0.05）。

表1 两组人群的一般资料及生化指标Tab.1 The general materials and biochemical markers in two groups ±s

表1 两组人群的一般资料及生化指标Tab.1 The general materials and biochemical markers in two groups ±s

变量年龄（岁）绝经年限（年）身高（cm）体重（kg）BMI（kg/m2）腰椎 BMD（g/cm2）PINP（ng/mL）CTX（ng/mL）Sema3A（ng/mL）血清钙（mmol/L）血清磷（mmol/L）绝经后骨质疏松组（n=85）56.7±6.3 6.5±2.3 155.3±4.8 56.2±7.4 23.0±2.8 0.845±0.079 54.64±8.79 0.524±0.026 4.20±0.59 2.32±0.15 0.98±0.15对照组（n=90）56.4±6.1 6.7±2.5 155.5±5.0 56.4±7.6 23.2±3.0 1.149±0.069 45.13±9.16 0.413±0.025 6.89±1.06 2.34±0.17 1.04±0.13 P值0.745 0.18 0.245 0.741 0.196＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05

2.3 绝经后骨质疏松组血清Sema3A水平与各参数间的相关性85例绝经后骨质疏松妇女的血清Sema3A水平与腰椎BMD值呈显著正相关（r＝0.598，P＜0.01），与骨吸收指标CTX值呈显著负相关（r＝-0.629，P＜0.01），与骨形成指标PINP值呈较弱负相关（r＝-0.158，P＜ 0.05）。血清Se⁃ma3A水平与患者的年龄、BMI之间无相关性（均P＞0.05）。见表2。

表2 绝经后骨质疏松妇女血清Sema3A水平与各参数间的相关性Tab.2 The association between serum Sema3A level and parameters

3 讨论

3.1 BMD与血清CTX、PINP的关系骨密度，即单位体积或单位面积的骨量，是人体骨骼强度的重要指标。能够准确反应骨质疏松的程度[11]。骨密度测量方法较多，DEXA法测定的骨密度是全球公认的OP诊断金标准。本研究采用DEXA骨密度仪测量绝经后女性腰椎（L2～L4）骨密度，结果显示绝经后骨质疏松组腰椎（L2～L4）骨密度明显低于对照组（P＜0.01）。骨代谢生化指标是骨组织本身的代谢（分解与合成）产物，分为骨形成标志物和骨吸收标志物，前者反映成骨细胞活性及骨形成状态，后者代表破骨细胞活性及骨吸收水平[12]。骨代谢生化指标灵敏度高、易于检测，独立于年龄、骨密度等骨质疏松性骨折的风险因素，通过反映全身骨代谢的变化而反映骨质疏松性骨折的风险[13]。β⁃CTX和 PINP是国际骨质疏松症基金会推荐使用的骨代谢指标。CTX反映破骨细胞的活性，是敏感特异的骨吸收标志物[14]，PINP反映成骨细胞的活性，是敏感而特异性强的骨形成指标[15]。联合检测骨形成和骨吸收指标能对骨转换进行分型，预测骨丢失率，可用于鉴别个体是否存在快速骨丢失及易患骨质疏松，选择恰当的干预措施。本研究显示绝经后骨质疏松妇女骨吸收指标CTX水平与骨形成指标PINP水平均高于正常对照组，B M D与CTX和PINP成负相关，与文献报道[16]相近。反映了绝经后患者的骨代谢中破骨细胞活动加强，骨转换增加，绝经后骨质疏松症的发生可能是骨吸收的速度超过骨形成的速度所致，骨形成的增加继发于骨吸收的增加，是机体代偿的结果，这不同于老年性骨质疏松症。

3.2 血清Sema 3A与BMD、血清CTX、PINP的关系Sema3A是一种可溶性Ⅲ类轴突导向蛋白成员，其仅在成骨细胞中表达，与其受体神经纤毛蛋白1（neuropilin⁃1，NRP1）一起参与轴索导向及调节免疫反应等各种生理过程。研究TAKAYANAGI等[8]发现Sema3A可对破骨细胞和成骨细胞进行双重调节，Sema3a-/-小鼠和NrpISema⁃小 鼠（表达的NRP1缺乏Sema结合位点）有严重的骨病，表现为破骨细胞数量增加和成骨细胞数量减少。重组Sema3A经静脉注射至正常小鼠，可导致破骨细胞减少和成骨细胞增加，促进骨量积累。此外，用Sema3A治疗钻洞损伤诱导的小鼠骨缺损模型，可促进骨再生，并降低去势小鼠的骨质流失。作为目前发现的唯一可对成骨细胞和破骨细胞进行双重调节的信号通路，Sema3A/Nrp1对受损骨神经的轴突再生、骨骼发育和骨重建具有调控作用，在骨形成和骨吸收过程中具有重要意义[17-18]。

Sema3A对骨代谢的作用已得到研究的证明，但检测PMOP妇女血清中Sema3A的水平与骨代谢的国内外临床实验的研究尚少。LIU等[9]研究证实PMOP妇女的血清sema3A水平与骨形成标志物OC呈正相关，从而支持sema3A在小鼠研究中的骨保护作用。本实验研究发现绝经后骨质疏松组血清Sema3A明显低于对照组，并且Sema3A水平与BMD呈正相关，与骨吸收指标CTX水平呈负相关，Sema3A与患者年龄、BMI间无相关性，表明Se⁃ma3A可能参与了绝经后骨质疏松发病过程，在骨转换中发挥作用。近年来研究发现，Sema3A对成骨细胞和破骨细胞的双重调节的分子机制。丛状蛋白A（PlexinA）家族是Sema3A的主要受体，它和Nrpl形成受体复合物。PlexinAl在髓系细胞触发受体 2（triggering receptor expressed on myeloidcells⁃2，TREM2）和自然杀伤激活受体相关蛋白12（DNAX⁃activating protein of 12 kU，DAPl2）形成PlexnAl⁃TREM2⁃DAPl2复合体，为破骨细胞分化提供共刺激信号。Sema3A⁃Nrpl轴通过干扰PlexinAl和TREM2⁃DAPl2的相互结合来抑制RANKL诱导下的破骨细胞分化[19]，而破骨细胞分化及功能成熟，必须依赖于RANKL⁃RANK通路的激活。RANKL蛋白通过特异性结合破骨前体细胞膜上的RANK受体，促发级联反应，通过激活下游TRAF6⁃NF⁃κB和AP⁃1转录因子复合体（包括c⁃Fos）两条通路，从而激活活化T细胞核因子1蛋白（NFAT⁃cl），促进破骨细胞特异性基因ctsk、Acp5和Nfatcl表达，诱导前体细胞向成熟的有功能的破骨细胞分化。此外，Sema3A⁃Nrpl轴还可抑制RhoA的激活来阻止破骨前体细胞的分化。另外HAYASHI等[8]还发现，sema3A能抑制巨噬细胞集落刺激因子对骨髓源性单核／巨噬前体细胞的趋化作用，从而防止该细胞向骨吸收区迁移，减少对骨质破坏；Sema3A通过经典的Wnt⁃β⁃链蛋白信号通路来调节成骨细胞分化[20]。经典Wnt通路是促进成骨细胞分化的重要信号通路，其主要通过激活Racl表达，使β⁃catenin即β链蛋白在胞核内定位实现。sema3A与成骨细胞中的受体结合后可借助FARP2（一种鸟嘌呤核苷酸交换因子）上调Racl的表达，使β链蛋白在胞核内聚集，从而促进成骨细胞分化及功能成熟。

本研究显示绝经后骨质疏松患者的血清Se⁃ma3A水平降低，使成骨细胞活性减弱，破骨细胞活性增强，骨形成减低，骨吸收增加，骨量减少导致BMD降低。Sema3A水平降低可能是绝经后骨质疏松发生的重要原因之一。表明Sema3A在绝经后骨质疏松中的正性调节作用，对绝经后骨质疏松的治疗提供了新思路，并且外周血Sema3A水平反映了骨丢失的严重性，可用于监测治疗骨质疏松药物的效果。而Sema3A水平与骨形成指标PINP水平亦呈负相关，后者可能由于绝经后骨质疏松妇女的高骨转换率，机体代偿性骨形成增加导致。