华中地区汉族人群SLCO1B1与APOE基因多态性分析及临床意义

王京伟 李艳 乔斌 陈娟娟

武汉大学人民医院检验科（武汉 430060）

他汀类药物（statins），亦作羟甲基戊二酰辅酶A（hydroxymethyl⁃glutaryl coenzyme A，HMG⁃CoA）还原酶抑制剂，是临床降脂的首选药物，也是预防心脑血管疾病的重要药物之一。然而，他汀类药物的使用存在较大个体差异，部分患者可出现如肌肉毒性、肝毒性、神经毒性及胃肠道反应等不良反应，给临床医生在药物选择、用药剂量个体化及预后评估等方面均带来困扰。研究发现他汀类药物不良反应与遗传因素相关，尤其与有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1）编码基因SLCO1B1及载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因的单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）密切相关，SLCO1B1与ApoE的不同基因型对药物的疗效及不良反应差异巨大[1]。而我国由于遗传背景的差异他汀类药物使用不良反应的发生率远高于欧美国家[8]。因此进行APOE及SLCO1B1基因型检测对用药不良反应的风险提示具有重要的辅助诊断意义，可以协助临床对患者实施个体化用药指导[2]。本研究采用聚合酶链反应（PCR）-荧光探针法对华中地区心脑血管疾病患者和健康人群同时进行SLCO1B1和APOE基因多态性位点分析，从分子水平分析华中地区SLCO1B1和APOE基因多态性分布，为华中地区心脑血管疾病的防止和个体化治疗提供理论基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料分别收集从2016年1月至2017年6月武汉大学人民医院就诊并接受SLCO1B1和ApoE基因多态性检测的患者的EDTA⁃K抗凝静脉血918份，采用多重PCR-探针法对SLCO1B1和ApoE进行基因的多态性位点分析。就诊患者年龄19～99岁，平均年龄（60.06±14.26）岁，其中男604例，平均年龄（59.80±14.10）岁，女314例，平均年龄（60.68±14.50）岁。所有入选者籍贯均为华中地区汉族人，无血缘关系和异族通婚史。

1.2 仪器和试剂QuantStudio Dx实时荧光定量PCR仪（美国Life Technologies公司）；Smart LabAss⁃ist⁃32核酸自动纯化提取仪（台湾圆点奈米技术开发有限公司）；全血基因组核酸提取及纯化试剂（上海星耀医学科技发展有限公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度计（美国NanoDrop公司）；人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（武汉友芝友医疗科技有限公司，批号：18050904质控：试剂盒自带SLCO1B1基因*1b和*5和ApoE基因ε2和ε4弱阳性质控及空白对照）。实验所用的内参基因由武汉友芝友医疗科技有限公司生产。

1.3 SLCO1B1和ApoE基因多态性检测

1.3.1 基因组DNA提取采集受检者静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝，采用全血基因组核酸提取及纯化试剂提取基因组DNA，按试剂盒说明书进行操作。在96孔预装板的第1列和第7列加入全血样本400 μL，分别在提取反应板中第1列和第 7 列加入蛋白酶 20 μL，选择 Smart LabAssist⁃32核酸自动纯化提取仪上相应的提取程序进行自动化核酸提取。运行结束后第5列和第11列对应槽位为相应标本提取的DNA。用Nanodrop2000超微量分光光度计测量DNA的浓度与纯度，A260/A280在1.8～2.0，A260/A230＞2。根据定量浓度将DNA样本稀释至5～15 ng/μL进行PCR扩增检测，基因组DNA原液-20℃保存。

1.3.2 PCR扩增将23 μL SLCO1B1*1b反应液、SLCO1B1*5反应液、ApoE2反应液、ApoE4反应液及内标反应液依次加入到200 μL PCR 8联管内，再依次加入2 μL基因组DNA，总体积25 μL。同时做弱阳性对照和空白对照。将PCR反应管放置扩增仪中进行扩增，扩增程序为：37℃10 min，95℃预变性5 min；扩增阶段95℃变性15 s，60℃延伸60 s（设置在此阶段结束时采集荧光信号），共40个循环，反应体系为25 μL。荧光信号采集为FAM 通道（SLCO1B1*1b 388A、SLCO1B1*5 521T、ApoE2 526C和ApoE4 388T）、VIC通道（SLCO1B1*1b 388G、SLCO1B1*5 521C、ApoE2 526T和ApoE4 388C）和ROX通道（内标基因）。

1.3.3 结果判断试剂盒有效性判定：弱阳性对照：FAM、VIC、ROX通道Ct值 ≤ 32，扩增曲线有明显指数增长期。空白对照：FAM、VIC、ROX通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，无Ct值或Ct值≥38。样本有效性的判定：内标基因（ROX通道）的Ct值＜38，扩增曲线有明显指数增长期。样本基因多态性判定：相应通道的Ct值＜38，扩增曲线有明显指数增长期，则该通道代表的基因型为阳性。若Ct值≥38或无Ct值，则该通道代表的基因型为阴性。若仅FAM通道Ct值＜38，ROX通道的Ct值≥38或无Ct值则判断为纯和野生型；若仅ROX通道Ct值＜38，FAM通道的Ct值≥38或无Ct值则判断为纯和突变型；若FAM通道与ROX通道的Ct值均＜38，则判断为杂合型。

1.4 统计学方法各SNP位点的基因型频率和等位基因频率通过频率计算法计算。采用χ2检验分析各SNP位点是否符合Hardy⁃Weinberg遗传平衡，采用统计软件SPSS 21.0进行统计分析，计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 华中地区SLCO1B1与apoE基因多态性分布SLCO1B1基因388A＞G、521T＞C两个位点多态性与他汀类用药相关，携带突变基因的人群转运蛋白功能降低，因此发生肌病等副作用的风险较正常人群更高。两个位点可形成4种单倍型：SLCO1B1*1a（388A ⁃521T），SLCO1B1*1b（388G ⁃521T），SLCO1B1*5（388A⁃521C），SLCO1B1*15（388G⁃521C）[3-4]，和九种不同表型：*1a/*1a，*1a/*1b，*1b/*1b，*1a/*5，*1a/*15，*1b/*15，*5/*5，*5/*15，*15/*15，华中地区人群九种表型占比为7.63%、30.83%、40.96%、0.22%、5.12%、13.94%、0%、0%、1.31%，详见表1。根据服用他汀类药物后发生横纹肌溶解症或肌病的风险及服用药物的剂量将其分为正常代谢型（*1a/*1a，*1a/*1b，*1b/*1b）、中间代谢型（*1a/*5，*1a/*15，*1b/*15）患、弱代谢型（*5/*5，*5/*15，*15/*15）三类。华中地区上述三类患者的人群占比分别为79.41%，19.28%和1.31%，弱代谢型人群肝脏摄取药物能力较差，发生横纹肌溶解症或肌病风险较突变型患者高，需减少他汀类药物使用剂量[5]，是临床需要关注的对象。

ApoE基因388T＞C，526C＞T两个位点与他汀类药物的疗效相关，可产生三种不同的基因亚型 Apoε2（388T⁃526T），Apoε3（388T⁃526C），Apoε4（388C⁃526C）和 6种不同表型：E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4 和 E4/4[3，6]，其中，ApoE3/3 是野生型（Wild⁃type）。6种表型占比为0.64%、1253%、2.07%、68.41%、14.81%、1.53%，见表1。

根据不同基因型发生冠心病、心梗、脑梗、老年痴呆等的风险及服用他汀类药物的疗效将其分为三大类[7-9]，APOE保护类基因型（ε2/ε2，ε2/ε3），APOE 大众类基因型（ε2/ε4，ε3/ε3）和 APOE 风险类基因型（ε3/ε4，ε4/ε4），华中地区这三类人群的占比分别为13.18%。70.48%和16.34%，详见表1。各个基因型之间的差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 华中地区SLCO1B1和ApoE基因多态性分布结果Tab.1 General data of patients in Central China with different SLCO1B1 and ApoE genotypes

2.2 不同性别SLCO1B1和ApoE基因多态性分布差异男性患者的SLCO1B1基因的*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*5/*5、*5/*15和*15/*15表型所占比例分别为8.11%、30.13%、41.56%、0.33%、3.97%、14.24%、0%、0%、1.66%。女性患者各亚型所占比例分别为6.69%、32.17%、39.81%、0%、7.32%、13.38%、0%、0%、0.64%。男女患者SLCO1B1正常代谢型占比最重，分别为80.33%和78.66%，中间代谢型为18.54%和20.70%，弱代谢型为1.66%和0.64%。不同性别间除1a/15型有差异外其它各亚型间差异无统计学意义（P＞0.05），见图1A。

男性患者ApoE 基因ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε 3、ε3/ε4 和 ε4/ε4 表 型 所 占 比例分别为 0.99%、11.59%、2.15%、69.21%、14.40%、1.66%，女性依次为0%、14.33%、1.91%、66.88%、15.61%、1.27%。男女性患者ApoE大众类基因型占比最重，分别为71.36%和68.79%，保护类基因型为12.58%和14.33%，风险类基因型为16.06%和16.88%。不同性别间各表型之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1B。

2.3 华中地区基因型分布及等位基因频率分布基因型和各等位基因频率见表2，918例华中地区汉族人群中，SLCO1B1基因的388A＞G（rs2306283）位点共检测出野生型72例，杂合突变型330例，纯合突变型516例，等位基因突变发生率为74.18%。SLCO1B1基因的521T＞C（rs4149056）位点共检测出野生型729例，杂合突变型177例，纯合突变型12例，等位基因突变发生率为10.95%。

918例华中地区汉族人群中APOE基因的388T＞C（rs429358）位点共检测出野生型749例，杂合突变型155例，纯合突变型14例，等位基因突变发生率为9.97%。APOE基因的526C＞T（rs7412）位点共检测出野生型778例，杂合突变型134例，纯合突变型6例，等位基因突变发生率为7.95%。

图1 不同性别间SLCO1B1和ApoE基因多态性分布结果Fig.1 Distribution of SLCO1B1 and ApoE genotypes between different sexes

表2 SLCO1B1和ApoE基因多态性频率分布Tab.2 Frequency distribution of SLCO1B1 and ApoE genotypes

经χ2检验，SLCO1B1及APOE基因的上述多态性位点突变频率观察值符合Hardy⁃wenberg遗传平衡（P＞0.05），具有群体代表性。

3 讨论

他汀类药物不良反应相关的症状（statin⁃asso⁃ciate symptom，SAS），如肌肉症状、肝脏损害、中枢神经症状、糖尿病等[10-11]是导致患者早期减药或停药的主要原因之一。此外，长期服用他汀类可诱发轻度认知障碍或永久的痴呆[12]，减药或停药则可增加临床动脉粥样硬化性心血管疾病事件。因此，他汀类药物使用的获益与潜在风险间的评估已成为医患共同关注的问题。SLCO1B1和ApoE基因的SNP是药物代谢个体差异的分子基础，也是影响药物相互作用的重要原因。

位于12号染色体上的SLCO1B1基因的388A＞G、521T＞C多态性可引发功能缺陷，导致他汀药效和毒副作用的个体差异，是明确的遗传影响因素。SLCO1B1基因的388G会增加OATP1B1对某些他汀类药物的转运能力，个体血脂的降低水平明显高于其它基因型个体，因此388GG可增加他汀的药效[13]。521C可降低OATP1B1与底物的亲和力及转运活性，减慢药物代谢速率[14]，长期高剂量辛伐他汀会增加横纹肌溶解症的风险[15-17]。388A＞G、521T＞C两个多态性位点可形成4种单倍型和9种不同表型。

位于人类19号染色体上ApoE基因的388T＞C、526C＞T基因多态性是机体脂质代谢的调节因子，也是影响他汀类降脂疗效的主要因素，被认为是高脂血症及动脉粥样硬化性心脑血管病的候选易感基因。正常人群中Apoε2（388T⁃526T）携带者血浆TC、LDL⁃C水平低于Apoε3（388T⁃526C）型患者，他汀类药物降脂效果相对其它2型最好。而Apoε4（388C⁃526C）型患者TC、LDL⁃C水平要远高于Apoε3型，他汀类药物的降脂疗效往往不佳或无效，同时患冠心病、阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease，AD）和血管性痴呆（VD）的危险性也相对增加[18-19]。388T＞C，526C ＞T两个基因多态性可产生3种基因亚型和6种不同表型。

华中地区汉族人群中SLCO1B1基因以*1a/*1b、*1b/*1b基因型为主，占71.79%，说明华中地区多数汉族人群可耐受大剂量他汀类药物；APOE基因型中以ε3/ε3为主，占68.4%，说明华中地区多数汉族人群服用他汀类药物相对安全，坚持服药可以取得预期疗效。不同性别SLCO1B1及APOE基因型分布与人群总体分布趋势相同[12]。除SLCO1B1基因的*1a/*15亚型在男女性别中有差异外，其它均无差异。可见华中地区汉族人群中他汀药物的治疗有较高的敏感性，中等强度他汀类药物治疗便可有效地将多数患者的LDL⁃C水平将至可接受范围，因此不推荐华中地区患者大剂量、高强度使用他汀类药[20]。

918例受检者中发现同时具有APOE保护类基因型（ε2/ε2、ε2/ε3）和SLCO1B1正常代谢型（*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b）患者94例（10.24%），此类人群药物剂量耐受能力强，发生SAS、冠心病、心梗、脑梗、老年痴呆等疾病的风险较低，疗效好，是他汀类药物的最佳受益人群。同时具有APOE风险类基因型（ε3/ε4、ε4/ε4）和 SLCO1B1弱代谢型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）的患者1例（0.11%），该类人群药物代谢能力较差，发生上述不良反应的风险较高，治疗效果较差。该类人群应为他汀类药物的禁用人群。

单独具有APOE风险类基因型患者149例（16.23%），该类患者发生冠心病、心梗、脑梗、老年痴呆等患病风险较高，疗效较差。有AD家族史或记忆力已经明显衰退的人群需进行ApoE基因多态性检测，E4携带者的一级亲属（父母、子女以及同胞兄弟姐妹）均应进行ApoE基因多态性的检测及遗传咨询，对于患者健康生活指导和合理化用药都有重要意义，对高风险人群进行早期干预延缓AD的发生。单独具有SLCO1B1弱代谢型患者11例（1.20%），该类患者需严格控制药物使用剂量监测药物不良反应或考虑他汀类替代方案。由于患者长期服药，为了达到最大疗效和避免不良反应，筛查APOE风险类基因型及SLCO1B1弱代谢型，关注特殊人群对他汀药物的反应，对临床用药指导及健康管理至关重要[13]。

SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C存在高度的连锁不平衡，不同种族人群的分布存在很大差异。已有研究报道388A＞G在高加索人、非洲人和亚洲人中的突变频率分别为30%～45%、70%～80%和60%～90%。521T＞C在高加索人、非洲人和亚洲人中的突变频率分别为15%～20%，1%～2%和10%～15%[21]。本研究发现华中地区汉族人群中SLCO1B1 388A＞G和521T＞C的突变频率分别为74.18%和10.95%，均在已报道的亚洲人的突变频率范围内。本研究发现华中地区汉族人群中弱代谢型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）患者占比1.20%（11/918），同华南及云南地区分布比例接近，这可能与华中地区以汉族人群为主，民族多样性不强有关。可见华中地区汉族人群服用等量他汀药物后血药浓度低于其它种族人群，患肌病的风险性也相对更低。

因此，华中地区汉族人群的SLCO1B1 388A＞G和521T＞C基因突变具有自己的特点，临床用药时可根据这一特点适当调整给药剂量。

由上可知，APOE、SLCO1B1基因多态性检测对他汀类药物的疗效有重要联系，不同的基因型其用药风险不同，所使用的的药物剂量也有较大差异；华中地区汉族人群大部分人群对他汀类药物的敏感性较高（98.69%），只有极少数人群对他汀耐受性较差（1.31%），临床需要提高警惕，尤其是人群中分布较少的SLCO1B1弱代谢型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）及APOE风险类基因型（ε3/ε4、ε4/ε4）患者，加强临床用药指导及健康管理至关重要。

因此，检测SLCO1B1与APOE基因多态性检测对实现个体化治疗具有重要意义，正在使用或考虑使用他汀类药物进行治疗的患者进行SL⁃CO1B1和ApoE基因多态性检测，可实现个体化用药和安全用药。