高效液相色谱法同时检测氟唑环菌胺和咯菌腈

董文凯，孙启霞，韩金涛，齐晓雪，王滢秀，李 磊

（山东省农药科学研究院，山东省化学农药重点实验室，济南 250100）

氟唑环菌胺（sedaxane）是一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂。其通过干扰病原菌线粒体呼吸电子传递链上的蛋白复合体Ⅱ（即琥珀酸脱氢酶）来抑制病原菌线粒体呼吸功能，阻碍其能量的代谢，抑制病原菌生长并致其死亡。氟唑环菌胺适用于谷物、大豆、油菜、玉米、马铃薯、甘蔗和果蔬等作物，防治黑粉病、丝黑穗病、黑星病、灰霉病等病害。其常用于种子包衣处理，商品名为Vibrance[1-2]。咯菌腈（fludioxonil）为新型苯基吡咯类触杀型杀菌剂。其通过干扰与葡萄糖磷酰化有关的转运，来抑制病原菌菌丝体的生长，并致其死亡。咯菌腈适用于谷物、大豆、油菜、玉米、马铃薯、甘蔗和果蔬等作物，防治灰霉病、黑星病等病害。其既可用于叶面喷雾，也可用于种子处理，商品名为Celest、适乐时等[3-5]。氟唑环菌胺和咯菌腈两者复配不仅具有突出的防治病害能力，而且能促进作物生根[6]。

氟唑环菌胺的化学名称为N-[2-[1,1'-联环丙基]-2-基苯基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺，其有顺式和反式2种异构体，以反式异构体为主[7]。咯菌腈的化学名称为4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡咯-3-腈。氟唑环菌胺和咯菌腈的结构式见图1。

图1 结构式

关于氟唑环菌胺和咯菌腈复配产品的分析方法目前尚未见报道。本试验建立了同一色谱条件下分离测定8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂中有效成分的方法。方法操作快速、简便，分离效果好，准确度和精密度均能达到定量分析的要求。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器和自动进样器；Agilent色谱工作站；分析天平；微孔滤膜，0.45 μm有机膜。

乙腈（色谱纯）；新蒸2次蒸馏水；氟唑环菌胺标准品（质量分数99.5%）、咯菌腈标准品（质量分数99.8%），由农业农村部农药检定所提供；8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂（3.55%氟唑环菌胺＋4.45%咯菌腈），瑞士先正达作物保护有限公司。

1.2 液相色谱操作条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈＋0.1%磷酸水溶液（体积比65∶35）；流量：1.5 mL/min；柱温：30℃；检测波长：220 nm；进样体积：5 μL。保留时间：咯菌腈约为3.4 min，氟唑环菌胺约为4.2 min（反式）和4.7 min（顺式）。

标样溶液及试样溶液高效液相色谱图见图2、图3。上述操作条件为典型操作参数，可根据不同仪器特点，对给定的操作参数进行适当调整，以获得最佳效果。

图2 标样溶液高效液相色谱图

图3 8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂高效液相色谱图

1.3 测定步骤

1.3.1 标样溶液的配制

称取氟唑环菌胺标准品0.03 g（精确至0.000 2 g）、咯菌腈标准品0.04 g（精确至0.000 2 g），置于100 mL容量瓶中，先加入5 mL水，再用乙腈溶解定容，摇匀，过滤备用。

1.3.2 试样溶液的配制

称取试样0.8 g（精确至0.000 2 g），置于100 mL容量瓶中，先加入5 mL水分散溶解，再用乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤备用。

1.3.3 测定

在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针标样溶液的响应值相对变化＜1.5%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.3.4 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中氟唑环菌胺（咯菌腈）峰面积分别进行平均。试样中氟唑环菌胺（咯菌腈）的质量分数w（%）按下式计算。

式中：A1—标样溶液中氟唑环菌胺（咯菌腈）峰面积的平均值；A2—试样溶液中氟唑环菌胺（咯菌腈）峰面积的平均值；m1—标准品的质量，g；m2—试样的质量，g；P—标准品中氟唑环菌胺（咯菌腈）的质量分数，%。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

选用ZORBAX SB-C18反相柱，根据氟唑环菌胺和咯菌腈的理化性质，以乙腈为溶剂溶解样品，并选择乙腈＋水为流动相。以不同比例的乙腈＋水为流动相进行分离检测，为了得到更好的分离效果和峰形，在水中加入磷酸制成0.1%磷酸水溶液。结果显示，在1.2液相色谱条件下，氟唑环菌胺、咯菌腈与杂质能得到很好的分离，且峰形对称，基线平稳。

2.1.2 检测波长的选择

使用高效液相色谱仪的光谱数据采集功能，获得氟唑环菌胺和咯菌腈的紫外吸收谱图（见图4、图5）。试验选择220 nm为检测波长，既能保证氟唑环菌胺和咯菌腈有较强吸收峰，同时能避免溶剂干扰。

图4 氟唑环菌胺紫外吸收谱图

图5 咯菌腈紫外吸收谱图

2.2 线性相关性测定

采用1.3.1标样溶液配制方法，称取不同质量的标准品，配制系列标样溶液。氟唑环菌胺的质量浓度分别为0.120 0、0.180 1、0.300 1、0.480 2、0.600 2 g/L，咯菌腈的质量浓度分别为0.160 6、0.240 8、0.401 4、0.642 2、0.802 8 g/L。在1.2色谱条件下，依次进样，以氟唑环菌胺、咯菌腈质量浓度为横坐标，响应峰面积为纵坐标，绘制校正曲线。试验得到氟唑环菌胺线性方程为y=11 895x＋2.80，相关系数为1.000 0；咯菌腈线性方程为y=13 169x＋88.36，相关系数为0.999 8。结果表明，氟唑环菌胺、咯菌腈在测试质量浓度范围内线性关系良好。

2.3 精密度试验

在1.2色谱条件下对同一8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂平行测定5次，结果见表1。测得氟唑环菌胺标准偏差为0.01，变异系数为0.26%；咯菌腈标准偏差为0.01，变异系数为0.21%。该方法精密度较好。

表1 分析方法的精密度试验结果

2.4 准确度试验

在已知含量的8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂试样中分别加入一定量的氟唑环菌胺（咯菌腈）标准品，在1.2色谱条件下测定，计算回收率，结果见表2。由表2可知，该方法回收率较高，可以准确测定制剂中氟唑环菌胺（咯菌腈）的质量分数。

表2 分析方法的准确度试验结果

3 结论

本文建立了同时分离并测定8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂中有效成分的高效液相色谱分析方法。该方法线性关系良好，准确度和精密度较高，且具有快速、简便的特点，适用于8%氟环·咯菌腈悬浮种衣剂的质量控制。