啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对SD大鼠的胚胎毒性和致畸毒性

赵康涛，王清洪，林 健

（1.福建省疾病预防控制中心/福建省人兽共患病研究重点实验室，福建 福州 350001；2. 福建中医药大学，福建 福州 350001）

啤酒在正常冷冻温度下保藏时易形成一种不溶性胶质蛋白质——丹宁络合物，这种影响产品感官质量的混浊现象叫做“冷混浊”。纳米SiO2吸附剂是由无定形SiO2和高分子材料组成的一种新型多功能啤酒防冷混浊剂，它具有多孔结构，且内部表面积大。其孔径尺寸具有选择性去除啤酒中造成混浊的蛋白质的吸附能力[1]，又可选择性去除啤酒中聚合多酚，而保留其他有益蛋白质成分如相对分子质量较大的泡沫稳定性蛋白，可保持啤酒风味不变[2]。基于上述理由，啤酒厂家广泛采用纳米SiO2作为稳定剂。目前世界上已有50%左右的啤酒采用SiO2法处理，并有增长趋势。

纳米SiO2的毒理学研究热点之一是肺毒理研究，纳米SiO2对实验动物的肺部毒性显示纳米SiO2较微米SiO2可能有更强的致脂质过氧化、损害抗氧化系统倾向，能引起更严重的肺部急性损伤[3]。但有关纳米SiO2生殖毒性及胚胎毒性、遗传损伤等却鲜见报道。为了解啤酒抗冷混浊硅基吸附剂(以下简称硅基吸附剂)的胚胎毒性及致畸毒性，我们利用雌性SD受孕大鼠进行了研究，为合理利用该硅基吸附剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 受试物

啤酒抗冷混浊硅基吸附剂为硅基产品，白色粉末，SiO2含量68%，由美国PQ公司惠赠。

1.2 主要仪器和试剂

解剖显微镜(星火TX800139，河南星火仪器厂)，电子天平(JJ500，常熟双杰仪器厂)，不锈钢电子数显卡尺(广陆111-102B，桂林广陆数字测控有限公司)。茜素红、氢氧化钾、丙三醇(甘油)、冰醋酸、2,4,6-三硝基酚(苦味酸饱和液)、甲醛溶液均购自国药集团，分析纯。

1.3 实验动物及分组

清洁级，13周龄(90~100 d)SD大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号SCXK(沪)2007-0005。雌性未交配过的大鼠80只，雄鼠40只。购入后置于SPF级大鼠实验室[许可证号SYXK(闽) 2007-0006]观察3 d后进行试验。试验设3个剂量组，分别为啤酒抗冷混浊硅基吸附剂低(0.83 g/kg)、中(1.63 g/kg)、高(3.33 g/kg)剂量的水混悬液(高剂量浓度以能灌胃的最高浓度为准，其余剂量依次减半)，以及阴性对照组(蒸馏水)，共4组。

1.4 试验方法

参照文献[3]，将性成熟雌、雄大鼠按1∶1同笼后，次日早晨观察阴栓，阳性表示受孕成功，当天即定为孕期0 d。如果5 d内未受孕成功，则更换雄鼠，直至每组达到20只孕鼠，交配结束。检出的孕鼠称体质量并编号，按体质量随机分为4组。在孕期的第7~16 d，每天经口灌胃1次给予受试物(灌胃容积为10 mL/kg)。孕鼠于孕期第0、7、12、16和20天称取体质量[3]。

1.5 胚胎检查

大鼠妊娠第20天脱颈椎处死，剖腹取出子宫称质量，记录并检查吸收胎、死胎及活胎数[1]。并逐一记录胎仔的体质量、胎盘质量、身长、尾长，检查胎鼠外观有无异常。

将每窝1/2的活胎鼠(编号为偶数)去皮、去内脏及脂肪后，放入茜素红溶液染色，当天轻摇2~3次，待骨骼染成红色时为止。将胎鼠换入透明液A中1~2 d，放入透明液B中2~3 d。待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，检查骨骼数目畸形等。每窝的1/2活胎鼠(编号为奇数)放入Bouin’s液中，固定两周后观察胎鼠脏器的大小、形状和相对位置。

1.6 统计分析

2 结 果

2.1 孕鼠一般情况

孕鼠的生理体征、外观、行为、大小便、皮毛等均未发现明显异常。

2.2 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对孕鼠体质量的影响

与阴性对照组比较，啤酒抗冷混浊硅基吸附剂各剂量组孕鼠在不同时期的体质量及妊娠期体质量增量均未见明显改变(P均>0.05)，见表1。各剂量组孕鼠的子宫连胎质量及卵巢质量与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。

表1 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对孕鼠给药后不同时间体质量的影响( -x ±s，g)

2.3 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对胚胎形成的影响

啤酒抗冷混浊硅基吸附剂各剂量组孕鼠的着床数和活胎数与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；死胎率和吸收胎率与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)，亦未见明显剂量效应关系(见表2)。

表2 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对胚胎形成的影响

2.4 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对胎仔生长发育的影响

啤酒抗冷混浊硅基吸附剂各剂量组胎仔平均体质量、胎盘质量、身长、尾长等发育指标与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，各剂量组也未见明显差异(P>0.05)，见表3。

表3 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对胎仔生长发育的影响(±s，g)

表3 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对胎仔生长发育的影响(±s，g)

2.5 啤酒抗冷混浊硅基吸附剂对胎鼠外观形态、内脏、骨骼的影响

啤酒抗冷混浊硅基吸附剂各剂量组胎鼠外观畸形率、内脏畸形率、骨骼畸形率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，对照组1例内脏畸形为消化道发育不全，可能属偶发病例；所有骨骼畸形均为2、5胸骨缺失，认为属正常发育阶段，无生物学意义(见表4)。

3 讨 论

本试验主要研究经口给予纳米SiO2吸附剂后对SD雌性大鼠的致畸作用。过往研究主要着眼于SiO2颗粒的大小，即经鼻给予样品后，微米级的SiO2可引起肺组织损伤，肺部炎症、纤维化、DNA损伤甚至肺癌[4]，而纳米SiO则可以穿透血脑屏障、血眼屏障、血睾屏障甚至进入细胞核中，从而危害生物体的安全[5]。体外实验也表明纳米SiO所引起的细胞毒性，效应比微米SiO严重[6]。基于上述原因，纳米SiO对大鼠生殖毒性的研究相关报道中，其染毒方式也多是鼻腔滴注法[7]，纳米SiO可致雄性大鼠睾丸发生脂质过氧化，并影响精子数量、活力致生精障碍[8]。经口灌胃给予纳米SiO2染毒后，是否具有同样的生殖毒性效应，对大鼠胎仔是否有致畸作用，却鲜有相关报道。

本试验通过经口给予SD大鼠纳米级SiO2吸附剂，检测其致畸毒性。结果我们发现，0.83、1.67、3.33 g/kg硅基吸附剂染毒组胎鼠窝平均活胎数、活胎率、吸收胎数、吸收胎率、死胎数及死胎率与阴性对照组比较均未见明显差异；胎鼠体质量、身长、尾长等各项发育指标与阴性对照组比较也未见明显异常(P>0.05)。此前有报道纳米SiO2粉体对妊娠小鼠呼吸道染毒，发现各染尘组的母鼠体质量、胚胎数、活胎数、活胎平均体质量均显著低于对照组；而死胎率和吸收胎率较对照组均显著增高。妊娠期间母鼠体质量变化值与活胎体质量之间存在显著的相关性[9]。而本实验室结果与之前报道并不相符，我们推测与染毒方式不同致其吸收代谢差异有关。上海大学杨怡新[10]用纳米SiO2食品添加剂对体外胃肠道细胞毒性的研究发现，纳米SiO2不造成细胞膜损伤、形态改变、细胞凋亡与坏死，只会抑制细胞的增殖，且存在剂量和时间效应。对纳米SiO2在Caco-2细胞单层膜的跨膜情况进行研究，发现纳米SiO2穿膜率很低，据此推测纳米SiO2很难穿越小肠膜[10]。本试验样品经胃肠道给药而未见致畸毒性，与之前致畸相关文献报道结果不符，是否为纳米SiO2穿膜率低而不易经肠道吸收所致，有待进一步研究。

本试验中胎鼠的外观、内脏未见畸形，骨骼畸形均为2、5胸骨发育不全，其畸形胎鼠数量也未超出正常范围。因此我们认为，本试验在3.33 g/kg剂量以下，该硅基吸附剂产品对SD大鼠胎仔无致畸作用。其机制是否与前述研究中胃肠道对纳米SiO2的屏蔽作用有关，有待我们进一步研究。而试验中，我们可见孕鼠体质量增长及妊娠期第0、7、12、16和20天体质量与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但3.33 g/kg组孕鼠体质量在 第 1 6和20天 的体质量却略低于对照组，且体质量增量绝对数值也略低于对照组，是否因该剂量组样品抑制动物胃肠道细胞增殖从而影响饲料摄入有关，也有待我们进一步试验考证。

纳米SiO2是我国目前产量最大的纳米材料之一，因具有优越的稳定性、易散性和融变性等特点， 已经被广泛应用于塑料工程、生物医学工程、杀菌剂、食品加工等多个领域。这就意味着纳米SiO2的研究者、生产者、消费者乃至消费品处理者以及其进入环境后涉及的整个生态系统接触它的机会大大增加。因此，对其相关产品的安全评估必将引起越来越多的重视。