Notch信号通路相关蛋白在腺性膀胱炎和膀胱癌中的表达与意义

黄壮程，王宏浩，沈沛麟，林明恩，何学军*

（汕头大学医学院第一附属医院泌尿外科，广东汕头 515041）

泌尿系统最常见的恶性肿瘤是膀胱癌，在常发恶性肿瘤中居第10位，其中超过90%是膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cell carcinoma，BUC)。膀胱癌首选手术治疗联合术后膀胱灌注治疗，由于膀胱癌具有时间上反复发作和空间上多中心性的特点，50%~70%的膀胱癌患者，经治疗后5年内复发，并较首发时恶性程度更高[1]。因此，迫切需要从根本上了解膀胱癌的发生和发展机制，为膀胱癌诊断、靶向治疗及预后监测提供新方法。

腺性膀胱炎(cystitis glandularis，CG)于1887年由Von Limbberk首次报道，是一种膀胱黏膜增殖性、化生性病变，其病因至今尚未完全明确，多认为与慢性刺激黏膜上皮使其化生为腺性上皮相关[2-3]。目前有认为CG是正常的生理现象，主张保守治疗，也有认为CG是癌前病变，建议积极处理[3]。在CG与膀胱肿瘤的关系尚无定论的情况下，如何治疗CG存在较大争议。

Notch信号通路广泛存在于各种动物细胞的生物学行为中，参与调控细胞增殖、分化和死亡等多个过程，对组织、器官的分化和发育具有重要作用。当Notch信号通路异常激活时，细胞分化异常并可能形成肿瘤[4]。Notch1是该通路的重要受体，Hes1是通路下游重要的转录因子，通过分析其表达，可间接反映Notch信号通路的强弱。

本研究采用免疫组织化学(SABC法)技术分别检测正常膀胱组织、CG和膀胱癌组织中Notch1、Hes1的表达，以探讨其在CG形成和肿瘤发展中的作用及意义，并尝试探讨CG与膀胱癌发生的关系，拟为CG以及膀胱癌的预测、诊断、治疗、预后、复发监测提供临床新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料

标本收集自2016—2017年汕头大学医学院第一附属医院泌尿外科，由临床经验丰富的泌尿外科医师主刀，50例膀胱癌标本均经术后病理确诊，其中男39例，女11例；按WHO 2004膀胱癌组织病理学分为：低级别乳头状尿路上皮癌15例；高级别乳头状尿路上皮癌35例。全部病例术前均无放、化疗。收集经术后病理确诊的CG组织26例，其中女性21例，男性5例；年龄36～75岁。对照组为16例膀胱正常组织，术前均经患者或家属同意。所有标本均由本院病理科医师复核。

1.2 主要试剂

兔抗人Notch1单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人Hes1单克隆抗体购自美国Abcam公司，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液均购自博士德生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验步骤 免疫组化采用SABC法。所有组织均经4%多聚甲醛固定、常规取材、脱水、石蜡包埋、4 μm切片，用于HE染色和免疫组化染色。按照SABC法试剂盒说明书操作，DAB显色后封片，显微镜拍照。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 结果判断 实验结果使用半定量积分法分析[5]，随机观察5个400倍视野，观察染色质的染色深度并计算着色细胞总数，计算评定结果，见表1。

*由阳性细胞和染色强度记分相乘所得.

1.4 统计分析

使用统计软件SPSS 22.0处理，采用 χ2检验分析两组间计数资料，检验水准 α=0.05。

2 结 果

2.1 Notch1和Hes1在CG和BUC组织中的表达

Notch1和Hes1在BUC、CG组织和膀胱正常组织中均有阳性表达。分析结果显示，Notch1和Hes1在正常膀胱组织中大部分为阴性表达(评定结果计分为0~1分)，Notch1阳性表达率为25%(4/16)，Hes1为18.75%(3/13)。在BUC组中，Notch1和Hes1表达从阴性到强阳性不等，主要位于胞质及胞核，评定结果计分为0~8 分 ， Notch1阳 性 表 达 率 为70%(30/50)，Hes1为76%(38/50)。而在CG组中，两者表达结果计分均为0~4 分 ，其中Notch1阳性表达率为65.38%(17/26)，见图1。BUC和CG组中Notch1、Hes1蛋白表达均较正常膀胱组织高，见表2，差异均有统计学意义(P<0.05)，而CG组和BUC组中两者之间表达的差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1和Hes1在CG和BUC的表达中，随着膀胱细胞异质性愈明显，其阳性率愈高。

表2 Notch1和Hes1 在 正常膀胱组织、C G 及 B UC 组织中表达情况

2.2 Notch1和Hes1在BUC组织中的表达与临床病理指标的关系

Notch1和Hes1表达强度均随BUC病理分级升高而升高，染色强度亦加深(P<0.05)。且Notch1随着BUC患者年龄增高阳性表达率升高(P<0.05)，性别对于Notch1和Hes1在CG和BUC组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

图1 Notch1和 Hes1 在 正常膀胱组织、 C G 及 BUC组 织中的表达情况(× 4 00)

表3 CG及 B UC 中 N otch1和H es1表达与临床病理指标的关系

3 讨 论

人Notch受体家族包括 N otch1~4共4个成员，配体至今发现有5种：Jagged 1、Jagged 2(Serrate的同系物)、Delta 1、Delta 3和Delta 4(Delta的同系物)。经典的Notch信号通路的激活是Notch配体与受体结合后开始，生成激活形式即胞内区(Notch intracellular domain，NICD)，与细胞核中DNA结合蛋白结合后激活下游靶基因如 H es基 因[6]。在肿瘤的发生与发展中，Notch通路可表现为抑制或激活状态，从而起到抑癌或促癌作用。

3.1 Notch1与腺性膀胱炎及膀胱癌的关系

本实验研究发现，Notch1在CG、BUC组织中均有阳性表达，且表达较对照组差异均有统计学上意义，而CG组与 B UC组织之间表达无显著差异，提示CG与BUC可 能存在相关性。在 B UC中 ，Notch1随着 B UC病理分级的升高而表达增加，提示Notch1与 B UC侵袭性和转移可能相关，Notch1异常激活导致 B UC侵袭力增加。据研究统计，Notch1的异常活化出现在10%~15%的头颈部鳞状细胞癌中，是第 2常见的突变基因[7]。在膀胱癌中，已有研究[8]表明在高级别膀胱癌中Notch1呈高表达，与本实验类似。可见Notch1的异常活化常常与肿瘤的发生相关，在CG中也可见Notch1的活化，提示CG亦有类似肿瘤的生物学行为。

3.2 Hes1与腺性膀胱炎及膀胱癌的关系

Hes1是Notch途径的重要组成成员，主要调节各种细胞生理过程及表观遗传，包括细胞分化、周期调控及细胞更新能力，常发挥转录抑制因子的作用。在本实验中，Hes1在正常膀胱组织、膀胱癌组织及CG组织中均存在阳性表达，且与正常膀胱组织间的差异均有统计学意义，而CG与膀胱癌组织中Hes1阳性表达无显著差异，提示CG与膀胱癌存在相关性。在鼻咽癌中，Hes1通过下调肿瘤抑制因子(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，促发上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)驱动，促进鼻咽癌的侵袭和转移[9]。因此我们推测，Hes1作为Notch信号通路的下游靶向因子，在Notch信号通路调节下，参与肿瘤发生、发展，其传递Notch信号，促使正常膀胱细胞发生腺上皮化生，维持膀胱肿瘤细胞的未分化状态，使其处于增殖状态，并可能介导CG癌变。

3.3 Notch信号通路与腺性膀胱炎及膀胱癌关系

1958年Shaw等首次报道了1例CG患者经过5年转变为腺癌后，关于CG与膀胱肿瘤的研究越来越多。CG与癌变的关系目前还未肯定。有学者认为它是一种癌前病变。有实验[10]证明，CG和膀胱癌组织中的CCND1、 C CNA1、 EGFR、 AR、 C X3CL1、 C XCL6、CXCL1等促癌基因的mRNA表达水平显著高于正常对照组；姚友生等[11]通过观察分析458例女性CG患者，其中2例CG患者出现腺癌改变。从危险因素上看，CG与膀胱癌均与长期慢性刺激相关，CG有发展成癌的可能。目前来看CG为一种良性病变，但其与膀胱癌相关，而且膀胱腺癌恶性度高、早转移 、 复发率高，因此进一步确认CG与膀胱癌之间的关系，并尝试提出诊断及治疗CG新方案，对CG的诊治有重要的临床意义。

近年来，越来越多的研究表明，上皮-间质转化(EMT)在癌症转移和侵袭过程中起到关键作用。EMT可促使癌细胞增殖、转移。研究表明，Notch信号通路可通过上调 C DH1基因(编码E-钙黏着蛋白)的转录抑制因子：SNAI1和SNAI2，从而驱动EMT。在乳腺癌中，Notch信号通路的激活通过上调SNAI2诱导EMT[12]。膀胱癌中已有研究发现Hes1的活性降低时，EMT效应被抑制。因此我们推断，在CG患者中，由于Notch信号通路的异常活化，激活下游靶基因 H es1，通过下调PTEN或驱动EMT等途径，导致正常膀胱上皮化生，形成Brunn巢，接着巢中心腺样化生，形成腺性膀胱炎，在异常活化的Notch信号通路作用下，病变的细胞无法自行修复，对后期CG进展为膀胱癌起到关键作用；而在膀胱癌患者中，Notch信号通路的异常激活，不仅维持膀胱癌变细胞存在，使得细胞凋亡能力下降，同时通过增加实体肿瘤内新生血管形成，增加血运，在肿瘤的发展、侵袭与浸润转移中发挥关键作用。

本实验结果显示，Notch1和Hes1在正常组织存在表达，而在膀胱癌和CG组织中存在高表达，且随着病理分级升高，Notch1和Hes1表达亦增高(P<0.05)，同时我们发现，Notch1和Hes1的阳性表达随着膀胱细胞异质性的明显而升高。这些结果表明，Notch信号通路在CG和膀胱癌发生、发展存在并密切相关。有学者认为CG为癌前病变，需要积极处理，我们推测，Notch信号通路在CG发展为膀胱癌过程中起到一定作用，因此我们建议可在CG患者中监测Notch信号通路关键因子水平，作为CG诊断及选择治疗方案指标之一。在膀胱癌患者中，我们通过实验证实Notch1和Hes1的高表达，其可能作为早期监测膀胱癌复发的指标之一。Notch信号通路常与恶性肿瘤预后不良相关，因此，Notch1及Hes1可能作为膀胱癌的预后指标。

综上，CG的病因尚未完全明确，其与膀胱癌之间是否存在相关尚无定论，若能明确CG与膀胱癌之间的关系，可能为CG诊治提供思路。通过本实验，我们发现Notch1和Hes1可作为CG及膀胱癌早期诊断的敏感指标，对于临床病理诊断CG并且Notch信号通路异常激活者，建议予以手术治疗，并考虑给予膀胱灌注化疗及规律随访。对于膀胱癌患者，Notch信号通路与其发生、发展密切相关，可作为其诊断、复发监测、预后评估的指标之一。