miR-34a及其下游基因在铁超载大鼠非酒精性脂肪肝发生过程中的作用

曹 玥，孙梦云，蔡静明，张立加，赵 艳*

（哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081）

microRNA作为一类内源性非编码单链小分子RNA，是基因调控网络的重要参与者和调节者[1-3]。近年来发现，microRNA可参与脂代谢，从而调节非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发生发展[4-5]。NAFLD被认为是与胰岛素抵抗、肥胖和血脂异常等密切相关的一种临床病理综合征，但其发病机制尚未完全阐明[6-8]。

miR-34a参与多种病理生理过程，如脂肪酸氧化和合成，脂肪和胆固醇代谢以及细胞凋亡等。研究显示，miR-34a可能与NAFLD的发生发展相关[9]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶，已被证实为miR-34a的靶基因之一，也是miR-34a特征性的直接作用靶点[10]。SIRT1可改善外周胰岛素抵抗、调节肝脏脂质代谢、改善氧化应激及线粒体功能障碍和减弱炎症反应等，从而在改善NAFLD肝脏病变中起着重要作用[11]。

目前已经发现miR-34a 在NAFLD的发生发展中起着重要的调节作用，但在铁超载大鼠NAFLD发生中的作用尚不清楚。本研究在高脂饮食诱导大鼠建立NAFLD模型的基础上，给予高铁饮食干预，观察miR-34a及其下游基因在大鼠肝脏中的表达情况，进一步探讨NAFLD的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

5周龄清洁级雄性SD大鼠36只，体质量150 g左右，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)测定试剂盒购于日本Wako公司；SIRT1兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling公司 ； 过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α， PPARα)兔多克隆抗体购于英国Abcam公司 ； β-actin兔多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司； 辣根过氧化物酶标记的二抗购于中杉金桥公司；miRNeasy Mini试剂盒购于QIAGEN公司 ； 引物购于上海捷瑞生物工程有限公司 ； High Capacity cDNA RT和POWER SYBR GREEN购于Applied Biosystem公司。

1.2 主要仪器

全自动生化分析仪，中国日立有限公司；组织匀浆器，美国MP BIO公司；FluorChem E数字成像仪，美国Protein Simple公司；核酸测定仪，Gene Company Limited公司；实时荧光定量PCR仪，美国ABI 7500 Fast。

1.3 动物饲料

动物饲料为合成饲料。基础饲料参考Research Diets D12450H饲料配方，脂肪供能比为10%；高脂饲料参考Research Diets D12451饲料配方，脂肪供能比为35%；高铁饲料是在基础饲料中添加1%硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)；高脂高铁饲料是在高脂饲料中添加1%硫酸亚铁(FeSO4· 7H2O)。高脂饲料成分包括：酪蛋白(200 g/kg)、L-胱氨酸(3 g/kg)、玉米淀粉(72.8 g/kg)、麦芽糖糊精(100 g/kg)、蔗糖(172.8 g/kg)、纤维素(50 g/kg)、豆油(50 g/kg)、猪油(177.5 g/kg)、矿物质混合物(10 g/kg)、磷酸二钙(13 g/kg)、磷酸钙(5.5 g/kg)、柠檬酸钾(16.5 g/kg)、维生素混合物(10 g/kg)、猪胆盐(4 g/kg)、胆固醇(1.3 g/kg)。

1.4 实验动物分组及方法

适应性喂养1周后，按大鼠体质量随机分为：空白对照组(基础饲料)、高铁组(含1% FeSO4的基础饲料)、高脂组(脂肪供能比为35%的高脂饲料)、高脂高铁组(含1% FeSO4的高脂饲料)，每组9只。每周称量大鼠体质量，12周末剔除肥胖抵抗大鼠4只，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血。摘取肝脏，称取质量后部分肝组织于4%多聚甲醛溶液中固定保存，剩余部分于液氮中冷冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.5 大鼠肝脏油红O染色

采用肝脏油红O染色观察大鼠肝脏中脂质堆积程度。分别取各组用4%多聚甲醛溶液固定好的肝脏约50 mg，并用10%、20%和30%的蔗糖溶液进行梯度脱水，切片约10 µm，油红O染色10 min，经60%异丙醇分化后，双蒸水洗涤1~2 min，苏木精复染1 min，甘油明胶封片，光学显微镜下观察。

1.6 血清ALT、AST含量测定

取实验大鼠血清300 µL于全自动生化分析仪检测大鼠血清中ALT和AST的水平。

1.7 实时荧光定量PCR检测miR-34a及其下游基因的表达

分别取每只大鼠新鲜冰冻肝组织25 mg，使用miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA，测定RNA纯度及浓度后，根据High Capacity cDNA RT逆转录试剂盒使用说明将RNA样品逆转录为cDNA。再以cDNA为模板，使用POWER SYBR GREEN试剂盒，进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)。反应条件为：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s(40个循环)，分别采用 U 6 和 β-actin为 内参照基因进行校准。用2-△△CT法计算目的基因的表达量，△△ CT=(CT， 实验组目的基因- CT，实验组内参) -(CT，对照组目的基因- CT，对照组内参)。相关引物序列见表1。

表1 实 时荧光定量 P CR引物序列

1.8 Western blot法检测miR-34a下游SIRT1和PPARα蛋白的表达

称取100 m g冰冻的大鼠肝组织，使用组织匀浆器充分匀浆，用强效裂解液在冰上裂解1 h后，4 ℃、15 000 r/min离心15 min，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品加入上样缓冲液，加热变性后等量上样，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，4 ℃转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，加入SIRT1、PPAR α、 β -actin一抗4 ℃过夜，用TBST漂洗3次。加入二抗，室温孵育1 h，TBST中漂洗3次。ECL法显色，数字成像仪拍照。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 高脂高铁饮食对大鼠体质量的影响

实验开始时各组大鼠体质量无统计学差异，12周时高脂组和高脂高铁组大鼠体质量均明显高于对照组(P<0.05)。见图1。

图1 高脂高铁饮食对大鼠体质量的影响

2.2 大鼠肝脏油红O染色结果

大鼠肝脏油红O染色结果显示，与对照组相比，高脂组与高脂高铁组肝脏内红色脂滴的数量明显增加且体积增大，高脂高铁组脂滴体积大于高脂组。见图2。

图2 高 脂高铁饮食对大鼠肝脏的影响(油红 O 染 色，×200)

2.3 高脂高铁饮食对大鼠肝功能酶的影响

大鼠血清ALT和AST检测结果显示，高脂组和高脂高铁组大鼠血清ALT含量明显高于对照组(P<0.05)，而血清AST含量在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

与对照组相比，*<0.05.P

2.4 高脂高铁饮食对大鼠肝脏miR-34a表达的影响

qPCR检测miR-34a的表达结果显示，高脂组和高脂高铁组大鼠肝脏中miR-34a表达水平明显高于对照组(P<0.05)。见图4。

2.5 高脂高铁饮食对大鼠肝脏SIRT1和PPARα表达的影响

与对照组相比，高铁组、高脂组和高脂高铁组大鼠肝脏中SIRT1 mRNA及蛋白表达均显著降低(P均<0.05)；与高脂组相比，高脂高铁组大鼠肝脏中SIRT1的mRNA及蛋白表达水平也明显降低(P均<0.05)。见图5A和5B。

与对照组相比，高脂高铁组大鼠肝脏中PPARα mRNA和蛋白表达均明显降低(P均<0.05)， 高脂组仅PPARα蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与高脂组相比，高脂高铁组大鼠肝脏中PPARα mRNA及蛋白表达水平均明显降低( P 均<0.05)。见图5C和5D。

3 讨 论

NAFLD的显著特征是脂肪在肝细胞内过度沉积[12-14]。本研究采用高脂饮食诱导SD大鼠建立NAFLD动物模型，在12周的干预期内，大鼠体质量明显增加，肝组织内脂滴数量明显增多，体积明显增大，表明NAFLD大鼠模型成功建立，而且高脂高铁联合作用后，出现了更为明显的脂质堆积，表明铁超载加重了肝脏脂质沉积。

ALT与AST均为非特异性细胞内功能酶，主要分布于肝细胞内，当肝细胞受损时，其内所含ALT和AST释放入血，引起血液中ALT和AST浓度升高。为观察高脂高铁膳食对大鼠肝脏功能的影响，我们对大鼠血清ALT和AST含量进行检测。结果显示，高脂组和高脂高铁组大鼠血清ALT含量明显高于对照组。由此说明，随着干预时间延长，单纯高脂和高脂高铁膳食对大鼠肝功能的损伤加重。

研究发现，NAFLD患者的肝组织中miR-34a的表达显著上升[15]。 Shan等[16]发现，在高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝脏中miR-34a表达也上调。本研究结果显示，高脂组和高脂高铁联合组大鼠肝组织中miR-34a 的表达水平较对照组均显著上调，与上述结果一致。我们还发现，高脂和高脂高铁饮食可抑制大鼠肝脏SIRT1的表达。SIRT1作为miR-34a特征性靶点，在调节肝脏脂质代谢中发挥着重要的作用，并且miR-34a上调会抑制SIRT1的表达[17-18]。SIRT1下游的靶基因PPARα对于促进脂肪酸 β氧化，加速脂肪酸分解，以及减少氧化应激和抑制炎症反应起到关键作用[19-21]。本研究显示，在高脂组和高脂高铁联合组大鼠肝组织中，SIRT1表达下调会抑制下游靶基因 P PARα的表达，并且高脂高铁组与高脂组相比下降更明显。与高糖高脂饮食可下调非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠肝脏PPAR α的表达，从而增加脂质蓄积和氧化应激的结果一致[22]。

A：SIRT1 mRNA水平；B：SIRT1蛋白表达水平；C：PPARα mRNA水平；D：PPARα蛋白表达水平. 与对照组相比，*P<0.05；与高脂组相比，#P<0.05.

本研究结果提示，激活miR-34a及其下游基因的表达，可能是导致NAFLD大鼠肝脏脂质代谢紊乱，过量脂质在肝脏沉积的重要因素。高脂高铁联合作用后，miR-34a及其下游基因表达水平变化更为显著，肝脏脂肪堆积及损伤程度也更严重，表明高脂高铁联合作用可能进一步激活了miR-34a表达，进而抑制了其下游基因的表达，因此加重了NAFLD大鼠肝脏脂肪变性的程度。

综上所述，高脂饮食能够成功诱导大鼠NAFLD模型，铁超载可进一步改变大鼠脂质代谢过程，激活miR-34a表达，进而抑制其下游基因的表达，从而加重脂代谢紊乱，造成肝脏内脂质累积，并使肝脏损伤程度加重，促进NAFLD的发生发展，但其机制还有待于进一步研究和证实。