诊治山羊口疮病例

毛从剑，张焕容，张兴民

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041)

羊口疮是由羊口疮病毒引起的以患羊口唇、口角、鼻、乳房等部位皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂为特征的传染病。各年龄段的羊均能感染发病，山羊比绵羊易感，其中羔羊最易感，并常为群发性流行。该病一年四季均可发生，无明显的季节性，但多发于初春或春末夏初。截止到2014年，我国有24个省份报道过羊口疮病例的发生，且从2000年起，该病的报道逐年递增[1]，说明在我国养羊业中该病的发生及对该病的关注越来越多。该病发病严重时会导致患病羊进食困难、营养摄入不足而生长缓慢甚至死亡，造成严重的经济损失。2017 年 4 月，成都某山羊养殖场出现羔羊口疮疫情，主诉：该群母羊未免疫口疮疫苗，羔羊出生后也未免疫口疮疫苗。该口疮病例诊治情况报告如下。

1 发病情况

2017年4月，成都某山羊养殖场2周龄左右的哺乳羔羊先后出现不同程度的唇部、嘴角部及舌面红肿、生疮、疣状增生、部分病羊患部后期结痂后缓慢恢复健康，该病采用抗生素于患病部位局部注射或涂擦治疗无明显效果，羊只发病率较高，但较少死亡。

2 临床及剖检病变

临床可见病羊的唇部、嘴角部及口腔内侧壁及舌部生疮、进一步发展口唇部疣状增生(见中插彩版图1)，发病后期口疮结痂(见中插彩版图2)，颈前淋巴结化脓、肿大，其他脏器无明显病变。

3 实验室诊断

3.1 病料采集及处理 无菌采取羔羊口唇及口腔病变组织。取病变组织用无菌PBS漂洗3次后剪碎研磨，按1∶3 (W/V)加入无菌PBS制成混悬液，置-80 ℃冻融3次后加入终浓度为2 000 U/mL的双抗，4 ℃过夜，以8 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液分装至离心管，置-80 ℃备用。

3.2 病毒分离培养情况 MDBK细胞铺满至瓶底的80%左右时，将培养液弃去，用Hank′s洗涤1～3次，加入1.5 mL处理保存的病毒液，在37 ℃，5%CO2条件下感作1 h左右，弃去瓶内液体，加入含1%双抗和1%犊牛血清的DMEM细胞维持液继续培养，并逐日观察细胞，同时设正常细胞对照。连续盲传至第5代时，出现细胞病变，表现为细胞变圆、聚积、脱落；连续传代至第10代，细胞病变稳定出现在接毒后96 h。

3.3 核酸提取及PCR检测结果 用酚-氯仿法提取病变组织及细胞培养总DNA作为模板，PCR扩增检测羊口疮病毒B2L基因片段。采用文献[2]的引物序列如下：上游5′-CAC GGC CAC GAA CTT CCA CCT CAA-3′，下游5′-TCC CGC TCG AAG ACC GCA GAC AG-3′；预期目的片段大小为540 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为：PremixTaq12.5 μL，模板DNA 2. 0 μL，上下游引物各1. 0 μL，加ddH2O补足至总体积25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并将PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果经Blast序列比对后，确定扩增片段为羊口疮病毒的B2L基因片段，表明从发病羊口唇部病变组织和细胞培养物中均能扩增出特异性的羊口疮病毒B2L基因片段。

4 诊断结果

根据发病情况、临床症状、剖检病变和羊口疮病毒B2L基因片段扩增结果，确诊该养殖场发生羊口疮病例。

图3 MDBK正常对照细胞 (10×)

图4 MDBK产生细胞病变细胞 (10×)

图5 PCR电泳图

5 感染血清制备及应用

5.1 感染血清制备 对发生口疮2周龄以上的病羊无菌采取颈静脉血，将血液放入离心管中，待血液凝固后5 000 r/min离心10 min，吸出血清装至离心管中，加入终浓度为0.01%硫柳汞，置-80 ℃保存备用。

5.2 感染血清的应用 将制备好的感染血清用于刚发病的羔羊，每只羔羊口唇部肌肉注射1 mL，间隔两天再注射1次，同时配合抗生素治疗，结果初发口疮的病羔羊病情得到有效控制，一般在康复血清治疗后1周左右完全恢复健康。

6 讨论

根据病羊的典型临床症状，初步诊断为羊口疮病例，为了确诊，从具有典型羊口疮临床症状的发病黑山羊口唇部及口腔病变组织采集病料，用MDBK细胞作为病毒增殖细胞，盲传至第5代时出现特征性细胞病变，病变细胞出现变圆、聚集、拉网、脱落现象，与殷震[3]等描述的羊口疮病毒致细胞病变特征基本一致，并在羊口唇部及口腔病变组织、细胞培养液中检测到了羊口疮病毒特异性B2L基因片段，确诊该起病例为羊口疮病毒感染所导致。

近年来我国山羊口疮发病率不断上升，且羔羊

发生羊口疮的日龄越来越小，1周龄内羔羊发生口疮的现象越来越多，在此情况下，疫苗接种新生羔羊来不及起到有效保护作用，因此，只有通过母源抗体让羔羊出生后就能获得被动免疫保护。有研究表明，在孕羊产前接种羊口疮灭活疫苗2～3次，对新生羔羊有很好的保护效果[4-5]。本次山羊羔口疮疫情连续发生，持续1月以上，是由于该群母羊没有接种口疮疫苗，羔羊出生后也未免疫口疮疫苗，通过采用先期发病后至少两周的病羊血清治疗后期初发病的羔羊，对初发口疮病羔羊的病情得到了有效的控制，证明特异性的感染血清可用于初发口疮病羔羊的紧急救治[6]，特异性的抗病血清对初发口疮的病羔的治疗作用与母源抗体对后代羔羊的早期被动免疫保护作用是一致的。目前，对羊口疮病还没有特效治疗药物，因此对羊群的免疫接种是预防该病的关键，本病例中畜主未对母羊进行免疫，也未对初生羔羊进行口疮疫苗的接种，是导致该养殖场暴发羊口疮病例的根本原因。此外羊口疮病毒主要是由结痂病料引起的环境污染经受损的皮肤、黏膜感染机体，因此在日常管理中要注意保护羊只的皮肤、黏膜免受损伤；对羊舍、用具及周围环境及时消毒，以减少羊口疮病的发生。