辽宁绒山羊副结核分枝杆菌的分离鉴定及分子生物学检测

宋先忱，李 冰，朱延旭，张兴会，王世泉，郭 伶，徐 鹏，郭维军，刘孝刚

(1辽宁省畜牧科学研究院，辽宁辽阳111000 ； 2.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州121001 ；3.锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁锦州121002)

副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性传染病，以顽固性腹泻、逐渐消瘦、肠黏膜增厚为特征。主要感染牛、羊、鹿等反刍动物。该病1958年在地中海首次发现，同期我国内蒙古也发现了1例，随后该病迅速蔓延至全国大部分地区[1-2]，给我国牛羊饲养业带来了极大损失[3]。

辽宁南部地区某绒山羊养殖场，有少部分母羊产羔后陆续出现顽固性腹泻、逐渐消瘦，后期食欲废绝而衰竭死亡，剖检发现回肠和结肠肠黏膜增厚、肠系膜淋巴结水肿、脾脏明显萎缩等一系列临床症状和剖检病变，初步诊断为副结核病[3]，为了对本病进一步确诊，同时为今后绒山羊副结核病的诊断与防控工作提供科学依据，开展了本项试验工作。

1 材料与方法

1.1 病原分离鉴定

1.1.1 材料 病料来源，辽宁南部地区某绒山羊养殖场疑似副结核病羊1只，剖检后无菌操作采取心、肺、肝、脾、肾、肠系膜淋巴结及肠道内容物。

Dubods油酸琼脂培养基，购自招远拓普生物工程有限公司；石炭酸复红溶液、3%盐酸酒精(脱色剂)、碱性美蓝复染(复染液)均由本校微生物实验室提供。

1.1.2 方法 将心、肺、肝、脾、肾、肠系膜淋巴结6个部位的病料先用4%H2SO4处理30 min，经中和后再无菌操作接种到Dubods油酸琼脂培养基上，肠内容物及黏膜用刀片刮取，放入40 mL、0.75%HPC(氯化十六烷基吡啶)塑料管中，于室温下竖立48 h后以去污染物，再用滴管吸取沉淀物上层液体，接种于培养基中。

在37 ℃条件下培养9～13周，详细观察菌株生长情况，前8周每2周观察1次，后5周每2 d观察1次。出现疑似菌落样品，挑取单个菌落，进行抗酸染色镜检，观察是否符合副结核分支杆菌的形态特征。

2 分离菌的PCR检测

2.1 材料 DL-2 000 Marker，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；2×TaqMaster Mix(含染料)，购自北京全式金生物科技有限公司；核酸染料；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京天根生物工程技术有限公司；小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物的设计 选择王素华[4]设计的副结核分枝杆菌特性引物，预期产物246 bp，引物由(上海)生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 特异性引物相关信息

2.2.2 细菌基因组DNA提取 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书介绍的方法提取基因组。提取的基因组，置于-20 ℃冰箱保存备用。

2.2.3 PCR扩增 94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃终延伸5 min，最终4 ℃保存。PCR反应体系30 μL：模板3 μL、2×TaqMaster Mix 15 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 10 μL。

2.2.4 PCR产物电泳：PCR扩增后经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，取5 μL DNA Marker和5 μL PCR扩增产物加到样品孔，在1xTAE电泳缓冲液中，120 V 电压电泳30 min，在凝胶系统中观察结果。

2.2.5 PCR产物序列测定与分析：将PCR 产物胶回收，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，并将结果与GenBank中的基因序列进行比较分析。

3 结果

3.1 病原分离鉴定结果 经过9～13周培养后，在接种肝脏病料的培养基上长出乳白色、光滑、边缘整齐的菌落，见中插彩版图1，在接种心、肺、脾、肾、肠系膜淋巴结及肠内容物的6个培养基上没有长出上述形态的菌落，只有一些杂菌生长。挑取疑似单个菌落进行抗酸染色镜检后，可见不规则(单个、成丛)的红色短小杆菌，见中插彩版图2。

3.2 PCR检测结果 提取DNA基因组，对所分离出来的疑似羊副结核分支杆菌进行PCR扩增，PCR产物上样量每孔5 μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL-2 000 Plus DNA Marker为标准，可见在246 bp左右有明显的目的条带，与预期的目的条带大小一致，见图3。

3.3 测序分析结果 目的基因扩增产物测序结果为246 bp，见图4。通过BLAST在线比对，同源性在95%以上的有16株，其中与JⅡ-1961(CP022105.1)菌株同源性达100%，进一步证实了分离菌株为副结核分支杆菌。

图3 羊副结核分支杆菌PCR鉴定结果注：M∶DL-2 000 Plus DNA Marker ； 1：分离菌株 ； 2：阴性对照

图4目的基因扩增产物测序结果

4 讨论

副结核分枝杆菌主要从感染患病动物的粪便或内脏组织中分离获得，由于副结核病潜伏期长以及副结核分枝杆菌对培养基要求条件苛刻，造成该病原体初代分离非常困难，一般需要6～8周的时间才能生长出肉眼可见的菌落，长者可达6个月[5]。所以国内关于该病的病原分离鉴定方面的研究报道很少，吴建勇等[6]采集新疆地区发病奶牛的粪便病料，在HEYM培养基上经过8～12周时间成功培养出副结核分枝杆菌，并经PCR检测和基因序列比对分析证实新疆地区规模化奶牛场中存在副结核分枝杆菌感染。

本试验采集辽宁地区发病绒山羊的内脏组织和肠内容物病料，在Dubods油酸琼脂培养基上经过37 ℃、9～13周时间培养，经抗酸染色镜检结果表明，从发病羊的肝脏组织中成功分离出一株副结核分枝杆菌，并经PCR检测和基因序列比对分析进一步证实了分离菌即为副结核分枝杆菌。从而首次证实辽宁地区绒山羊饲养场中存在副结核分枝杆菌感染。

副结核分枝杆菌主要存在于感染患病动物的粪便或内脏组织中，本研究在同一只发病羊的肝脏中分离出副结核分枝杆菌，而在心、肺、脾、肾、肠系膜淋巴结及肠内容物6种病料组织中没有分离出副结核分枝杆菌，分析其中原因，可能与不同发病时期各内脏组织中的带菌量有关，具体原因还有待于进一步研究探讨。

关于副结核分枝杆菌的培养时间，各种文献说法不一，有6～8周或6个月[7]、5～14周[2]、8～12周[6]等，本试验为9～13周。笔者认为培养时间不存在绝对性，主要与使用的培养基成分和培养基的pH值有关，目前使用的培养基均不够理想，建议应加强副结核分枝杆菌培养基筛选和优化方面的研究，应该有很大的提升空间。

辽宁省是辽宁绒山羊的主产区，饲养规模已超过300万只，最新血清学调查结果显示，辽宁绒山羊主产区副结核病的感染率已超过10%，本试验进一步证实了辽宁地区绒山羊饲养场中副结核病的存在，建议相关部门应重视绒山羊副结核病的防控工作，保障辽宁绒山羊饲养业的健康发展。