β1-肾上腺素能受体基因编码区1165位单核苷酸多态性与肠道病毒A71感染的关系

李帮涛 雷智贤 李虹艾 崔兰 海元平 黄婷 向伟

570206海口，海南省妇幼保健院（海南省儿童医院）重症医学科（李帮涛、海元平、雷智贤、黄婷、向伟）；570206海口，南华大学附属海南医院儿内科（李虹艾）；570206海口，海南医学院附属医院儿内科（崔兰）

肠道病毒 A71型（enterovirus A71，EV-A71）呈高度嗜神经性，是引起重症手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）的最主要病原体。重症HFMD的发生机制非常复杂，其中儿茶酚胺类递质参与全身血管血流动力学变化，促进重症HFMD的进展［1］。 β1-肾上腺素能受体（β1-adrenoceptor，β1-AR）是介导儿茶酚胺作用的重要组织受体，其中最具有功能性意义的β1-AR位点可能为G1165C位点［2］，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）的置换突变可能产生具有临床意义的基因多态性。本研究对β1-AR基因编码区1 165位进行测序，探讨该位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与 EVA71感染的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 EV-A71感染组：2015年10月至2016年9月期间来自海南省妇幼保健院（海南省儿童医院）117例临床诊断为HFMD的患儿，其中EVA71感染77例，男性57例，女性20例，年龄2.3±1.2岁，其中轻症HFMD 22例，重症HFMD 55例，临床诊断标准均符合《HFMD诊疗指南（2010年版）》，经实验室检测咽拭子的病毒核酸PCR（荧光标记PCR法）阳性，或血清EV-A71 IgM抗体（北京万泰ELISA法）阳性为入组标准，确诊为EV-A71感染。健康对照组：同时期同地区我院门诊健康体检的儿童共66例，男性31例，女性35例，年龄2.9±1.1岁，且符合咽拭子的病毒核酸PCR和血清EVA71 IgM抗体阴性，无HFMD、中枢神经系统损伤、嗜铬细胞瘤、高血压及心脏、肾脏疾病等病史，排除EV-A71感染。 两组性别（χ2＝0.594，P ＝0.279）和年龄（t＝0.246，P＝0.130）比较差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：HFMD患儿急性期（病程前3 d内）咽拭子标本和静脉EDTA抗凝血3 ml（基因检测部分保存至-70℃冰箱）。

1.2.2 核酸检测：选择EV-A71 HFMD患儿77例和健康体检儿童66例进行核酸检测。用OMEGA血样DNA提取试剂盒（D3471-02）提取采集样本的基因组 DNA。 依据 NCBI发布的 β1-AR（GenBank序列号：NG＿012187.1）的编码区序列设计扩增引物， Arg389Gly UP： 5′-CAGAAACATGCTGAAGT CCCG-3′， Arg389Gly DOWN： 5′-GATGGGCAGGAA GGACACC-3′。引物由上海兰卫检验公司合成。PCR扩增反应总体系为25μl，其中10 × LAmp Buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，ADRB1-F1／F2／F3／F4 1 μl，ADRB1-R1 ／R2 ／R3／R4 1 μl，LAmp Taq 0.25 μl；5 ×C SolutionⅠ5 μl；DNA 模板1 μl，ddH2O 12.25 μl。 PCR 反应条件：99 ℃ 10 min；99 ℃ 30 s，60 ℃45 s，72 ℃ 90 s，共38个循环；72 ℃ 7 min。 PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR扩增产物进行Sanger测序。将获得的序列与NCBI ADRB1基因参考序列比对，确定SNP分型。

1.3 统计学方法 本研究应用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析，计数资料以频数或百分比表示，采用R∗C表χ2检验比较，P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SNP多态性分布的性别差异 从表1可看出，在男童中，EV-A71感染组和健康对照组C等位基因均占优势，但基因型频率经χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝0.135，df＝2，P ＝0.935）；等位基因频率经χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝0.069， df＝1， P ＝0.868）。 在女童中，EVA71感染组和健康对照组C等位基因均占优势，但基因型频率经χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝1.677，df＝2， P ＝0.432）；等位基因频率经 χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝0.866，df＝1，P＝0.380）。说明β1-AR基因编码区1 165位SNP基因型和等位基因无明显的性别差异。

2.2 健康对照组和EV-A71感染组SNP多态性分布比较 从表1可看出，66名健康儿童和77例EVA71 HFMD患儿均存在 β1-AR基因编码区1 165位SNP，有3种基因型：GG、GC和CC。 在EVA71 HFMD患儿中，GG、GC和CC基因型频率分别为10%、47%、43%，G、C等位基因频率分别为34%、66%；在健康儿童中，GG、GC和CC基因型频率分别为7%、41%、52%，G、C等位基因频率分别为28%、72%。EV-A71感染组与健康对照组相比，基因型频率经χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝1.154， df＝2， P ＝0.562）；等位基因频率经 χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝1.091，df＝1， P ＝0.296）。

表1 健康对照组和EV-A71感染组1 165位单核苷酸多态性基因型和等位基因频率的分布Tab.1 Distribution of single nucleotide polymorphism at locus 1 165 in EV-A71 and control group infection

2.3 EV-A71感染轻症组和重症组SNP多态性分布比较 从表2可看出，按严重程度分组进一步发现，EV-A71感染轻症组和重症组相比，基因型频率经χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝3.945， df＝2，P ＝0.139）；等位基因频率经 χ2检验分析，分布差异无统计学意义（χ2＝3.763，df＝2，P＝0.052）。说明β1-AR基因编码区1 165位 SNP与EV-A71感染及其严重程度无关联。

表2 EV-A71感染轻症组和重症组1 165位单核苷酸多态性基因型和等位基因频率的分布Tab.2 Distribution of single nucleotide polymorphism at locus 1 165 in the mild and severe group of EV-A71 infection

3 讨论

β1-AR基因已有多个SNP被识别，而G1165C位点是β1-AR基因编码区的主要功能位点，目前国内外学者针对β1-AR基因G1165C位点基因多态性的研究主要集中在心血管疾病［3-4］，与EV-A71感染的关系研究甚少。β1-AR核苷酸第1 165位核苷酸C被G替换，导致第389氨基酸由Gly变为Arg，多项研究表明Arg389β1-AR的腺苷酸环化酶（AC）活性水平较 Gly389β1-AR 显著升高［5-7］。 因此，结合EV-A71感染重症HFMD的儿茶酚胺风暴现象及G1165C位点的研究理论，理论上β1-AR G1165C位点的置换突变，参与G偶联调节细胞内cAMP水平和L型通道的开放频率，调节机体的生理功能，影响病情的严重程度。

由于遗传背景差异（包括常染色体和性染色体），不同性别的位点基因多态性分布可能存在差异。王浩等［8］发现男性和女性不同基因型携带者之间的静息心率存在统计学差异，β1-AR基因A145G位点可能与男性静息心率相关。但本研究发现G1165C位点基因型和等位基因在EV-A71感染组和健康对照组的分布无统计学差异，可排除性别对β1-AR基因G1165C位点基因型分布的影响。本研究对77例EV-A71 HFMD患儿和66名健康对照者的β1-AR基因编码区1 165位SNP基因型进行检测和分析，发现两组基因型和等位基因频率的分布无统计学差异，且按病情严重程度分析，发现轻症组和重症组的分布亦无统计学差异。提示β1-AR基因编码区1 165位SNP与EV-A71感染及其严重程度无关联，不会增加EV-A71感染和病情加重的风险。分析原因可能为：①可能存在HFMD的其他易感基因或β-AR基因上的其他SNP，与β1-AR基因编码区1 165位SNP相互作用或连锁不平衡。②EV-A71 HFMD的易感性不但受遗传因素，可能还受到病毒毒力、环境影响，单个基因突变引起的作用较小。③研究样本量偏小，且地区局限，可能对统计效能有一定影响。

因此在未来的研究中，应加强多中心、多样本研究β1-AR多态性位点，并关注与之存在连锁不平衡以及相互作用的其他基因SNP位点，同时研究EVA71感染HFMD儿茶酚胺水平与β1-AR基因多态性的关系，深化对重症HFMD发病机制的认识，从基因水平为HFMD的防治提供新的研究思路。

利益冲突 无