重庆地区耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的相关基因特征分析

胡彦 刘洁 沈静 朱大冕 冯鑫 陈林 詹建 欧喜超 周杨 赵雁林

耐药结核病尤其是耐多药结核病(MDR-TB)是全球及我国严重的公共卫生问题。我国是全球30个 MDR-TB高负担国家之一，2016年估算我国新发结核病患者89.5万例，耐多药/利福平耐药结核病(MDR/RR-TB)患者7.3万例，新患者和复治患者中MDR/RR-TB的发生率分别为7.1%和24%[1]。重庆是中国西部唯一的直辖市，辖39个区(县)，地区间发展不平衡，是结核病和耐药结核病的高发区，MDR-TB发生率为23.0%[2-3]。重庆地区结核病耐药疫情形势严峻。

在MDR-TB的治疗中，二线氟喹诺酮类(FQs)药物尤为重要，是组成MDR-TB治疗方案的核心药物。但随着FQs药物在抗感染及结核病治疗中的广泛及不当应用，其耐药率不断增加。 笔者前期报道了重庆地区MDR-TB菌株氧氟沙星(Ofx)耐药率为42.3%[3]，但对新一代的FQs耐药性报告尚少见。北京基因型菌株是中国的主要流行株[4]，和其他基因型比较，由于北京基因型和耐药性之间的高度关联，其在耐药结核病的传播中起着重要作用[5]。Parwati 等[6]报告北京基因型菌株有更高的药物耐药相关基因的突变频率，因此，本研究通过采用最低抑菌浓度(MIC)法对重庆地区新一代FQs药物进行耐药性检测，并对不同基因型的耐药突变位点进行分析，为重庆地区合理使用FQs药物进行MDR-TB治疗提供依据。

资料和方法

一、一般资料

收集2015年1月至2017年6月重庆市39个区(县)结核病防治机构报告的967例MDR-TB可疑患者，均痰涂片抗酸杆菌阳性。967例患者的临床分离株经菌种鉴定及比例法药敏试验，确定为MDR-TB菌株229株(23.7%)，分离自229例MDR-TB患者。其中，男173例，女56例；年龄17～79岁，平均(45.0士15.9)岁；初治患者84例，复治患者145例。

二、实验方法

1. 主要仪器和试剂：PCR仪为美国Bio-Rad CFX96 荧光定量PCR仪，Middle brook 7H9培养基购自美国BD公司(批号：5173939)，Alamar blue显色液购自美国Bio-Rad公司(批号：160905)，氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)和加替沙星(Gfx)药粉购自美国Sigma公司，批号分别为：SLBG3234V、BCBK5832V、SZBE216XV和SLBG5170V。

2. MIC检测：使用7H9液体培养基(7H9∶OADC=9∶1)，通过微孔板Alamar blue显色法测定FQs药物的MIC值。本研究FQs药物包括：Ofx、Lfx、Mfx、Gfx。MIC浓度梯度设置：0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml。刮取改良L-J(Lowenstein-Jenden)培养基上肉眼可见后1至2周的新鲜菌落，进行磨菌、比浊，制备1个麦氏(McFarland)单位浓度的菌悬液，50倍稀释后取100 μl接种到不同浓度梯度的7H9液体培养基中。37 ℃培养7 d后，加入70 μl显色剂(Alamar blue∶5% Tween 80=2∶5)，24 h后观察颜色变化判断MIC读数。MIC界定标准：蓝色完全没有发生改变的为最小药物浓度。耐药临界浓度参照文献[7-8]设置，Ofx、Mfx为2.0 μg/ml。Lfx、Gfx为0.5 μg/ml。

3. DNA提取：取适量经改良L-J培养基培养，生长良好的菌落置于生理盐水中，85 ℃孵育30 min灭活，离心收集菌体，用400 μl TE缓冲液悬菌，于95 ℃金属浴60 min，16 200×g离心3 min，吸取上清液即作为DNA模板。

4. 耐药基因PCR-测序：针对喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region，QRDR)设计PCR及测序引物，引物序列参照文献[3]，由北京擎科生物技术有限公司合成。PCR反应体系为50 μl，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μl、引物各1 μl，模板3 μl，去离子水20 μl。PCR 扩增条件：94 ℃ 变性5 min；94 ℃，1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃，1 min，35个循环；再72 ℃延伸10 min。PCR产物送北京擎科公司进行测序。测序结果通过在线比对软件http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.与标准菌株H37Rv的耐药相关基因序列进行比对分析。

5. 实时荧光PCR-熔解曲线基因分型：参照文献[9-12]，Rv2952基因用于鉴定北京与非北京基因型，mutT2基因用于北京基因型古代与现代型的鉴定。 采用10 μl反应体系：10×反应缓冲液1 μl、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 0.4 μl、上游引物0.05 μl(0.02 μmol/L)、下游引物1 μl(0.4 μmol/L)、探针0.2 μl(0.2 μmol/L)、酶 0.2 μl、DNA 0.5 μl、双蒸水6.65 μl。反应条件：预变性95 ℃ 2 min; 变性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 10 s，共40个循环，最终延伸72 ℃ 5 min。熔解曲线分析条件为：95 ℃变性5 min，40～80 ℃熔解曲线分析，每升高1 ℃采集1次荧光，检测FAM和ROX 2个通道。引物和探针序列由北京擎科生物技术有限公司合成，见表1。

二、 统计学处理

采用SPSS 19.0软件，两个或多个独立样本率的比较用卡方检验或Fisher确切概率法(样本量<40或理论频数<1时)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MDR-TB菌株FQs体外MIC结果

229株MDR菌株中，94株(41.0%，94/229)对任一FQs药物耐药，耐Lfx、Mfx、Gfx者均同时耐Ofx。Ofx耐药率最高，为41.0%(94/229)，Lfx、Mfx耐药率居中，分别为31.4%(72/229)、30.6%(70/229)，Gfx耐药率最低，为20.1%(46/229)。复治患者的4种FQs药物耐药率均高于初治患者，但差异均无统计学意义。进一步分析发现，229株MDR菌株中Ofx耐药率明显高于Lfx(χ2=4.573，P=0.032)、Mfx(χ2=5.471，P=0.019)、Gfx(χ2=23.702，P=0.000)；Lfx、Mfx的耐药率明显高于Gfx(χ2=7.717，P=0.005；χ2=6.650，P=0.010)(表2)。

二、FQs耐药相关基因分子特征与MIC分布

94株氟喹诺酮类耐药表型菌株中，81株发生gyrA基因突变，突变率为86.2%(81/94)，涉及6个密码子，共9种突变类型，分布在74、88、89、90、91和 94位点，94位突变频率最高，为60.6%(57/94)。其中有7株为gyrA基因双位点突变，显示为高水平耐药(Ofx、Lfx≥16 μg/ml，Mfx、Gfx≥4 μg/ml)，1株显示为Gfx中等水平耐药(Gfx: 2 μg/ml)。gyrA基因单位点突变主要类型为Asp94Gly(30株)、Ala90Val(16株)、Asp94Asn(7株)，其中，Ala90Val显示为中低水平耐药(Ofx、Lfx≤8 μg/ml，Mfx、Gfx≤2 μg/ml)。在135株氟喹诺酮敏感的MDR菌株中，有10株(7.4%，10/135)发生gyrA基因突变(表3)。

与gyrA基因相比，gyrB基因较少发生突变。94株氟喹诺酮耐药株中，10株(10.6%)发生了gyrB基因突变。1株为单一突变，突变类型为Gly512Arg。9株发生了gyrA与gyrB基因的联合突变，其中Asp94Gly+Ala504Thr、Asp94Gly+Ala504Val显示为高水平耐药(表3)。

表1 基因分型 PCR引物及探针序列

表2 MDR-TB菌株对4种氟喹诺酮类药物的药物敏感性结果

注初治患者中，a：与Lfx比较，χ2=1.380，P=0.240；b：与Mfx比较，χ2=1.380，P=0.240；c:与Gfx比较，χ2=6.035，P=0.014；d：与Mfx比较，χ2=0.000，P=1.000；e:与Gfx比较，χ2=1.698，P=0.193；f:与Gfx比较，χ2=1.698，P=0.193。复治患者中，g:与Lfx比较，χ2=3.242，P=0.072；h:与Mfx比较，χ2=4.190，P=0.041；i：与Gfx比较，χ2=18.000，P=0.000；j：与Mfx比较，χ2=0.062，P=0.804；k：与Gfx比较，χ2=6.184，P=0.013；l：与Gfx比较，χ2=5.028，P=0.025

表3 MDR-TB 菌株gyrA、gyrB基因分子特征与最低抑菌浓度分布

注a：至少1种氟喹诺酮类药物耐药；b：4种氟喹诺酮类药物均敏感

三、基因分型

229株MDR菌株中，非北京基因型菌株39株(17.0%，39/229)，北京基因型菌株190株(83.0%，190/229)。北京基因型中，古代型79株(41.6%，79/190)，现代型111株(58.4%，111/190)。在94株FQs耐药株中，非北京基因型菌株14株(14.9%，14/94)，北京基因型菌株80株(85.1%，80/94)。北京基因型中，古代型32株(40.0%，32/80)，现代型48株(60.0%，48/80)。

四、耐药基因在不同基因型间的突变情况

94株氟喹诺酮耐药株中，gyrA、gyrB基因突变在北京与非北京基因型菌株间的分布见表4。进一步分析发现，gyrB基因突变率在非北京基因型、北京基因型古代型与现代型之间分别为2/14(14.3%)、8/32(25.0%)和0/48(0.0%)，现代北京型的gyrB基因突变率明显低于古代北京型(χ2=10.700，P=0.001)和非北京型(Fisher确切检验，P=0.048)。

讨 论

在MDR-TB的治疗中，氟喹诺酮类药物尤为重要，是组成MDR-TB治疗方案的核心药物之一。本研究发现，重庆地区MDR-TB 菌株任一FQs药物的耐药率为41.0%，接近巴基斯坦的47%[13]，但远高于WHO报告的全球MDR-TB/RR-TB患者中对任一FQs的耐药率20.0%[1]及我国台湾地区的28.6%[14]，说明重庆地区对FQs的耐药情况较为严重。初治患者4种FQs药物的耐药率虽均低于复治患者，但差异无统计学意义，说明重庆地区FQs药物原始耐药情况并不乐观，可能是因为近年来FQs药物在临床上作为广谱抗生素被广泛应用于抗感染治疗，不规范使用增加了其耐药性。进一步分析发现，初治患者的Ofx耐药率与Lfx、Mfx差异无统计学意义，但显著高于Gfx，可能与在一般抗感染治疗中，重庆地区相对较少使用Gfx有关。在复治患者中，对Ofx的耐药率与Lfx的差异无统计学意义，但明显高于Mfx；对Gfx的耐药率均明显低于Ofx、Lfx、Mfx，可能与先前重庆地区较为普遍地使用Ofx、Lfx治疗耐药结核病有关。

表4 94株氟喹诺酮耐药株gyrA和gyrB基因在北京与非北京基因型间的突变情况

注表中括号外数值为“菌株数”，括号内数值为“比率(%)”；表中“-”表示不适用该统计方法

FQs药物主要作用于细菌的 DNA 旋转酶，使细菌 DNA 复制受阻，从而导致细菌死亡。DNA旋转酶是由2个 A亚单位(GyrA)和2个 B 亚单位(GyrB)组成的四聚体，分别由gyrA和gyrB基因编码[15-16]。由于不同地区结核病的流行病学、研究人群、二线抗结核药物的使用情况等不同，各国家和地区所发现的gyrA、gyrB基因突变位点及频率尚存在差异。本研究MDR结核分枝杆菌FQs耐药株gyrA基因突变率为86.2%，高于我国台湾地区的72.4%[17]、江西的82.1%[18]，低于华东地区的89.5%[19]。本研究中的突变位点包括74、88、89、90、91和94位密码子，其中以94位密码子突变最常见，占60.6%(57/94)，与华东地区、江西省报道的最常见突变位点一致，分别是56.8%和69.2%[18-19]。本研究发现了7株gyrA基因双位点突变，与高水平耐药相关(Ofx、Lfx≥16 μg/ml，Mfx、Gfx≥4 μg/ml)。gyrB基因发生突变的比例较小。94株FQs耐药株中，10株(10.6%)发生了gyrB突变，高于江西的5.1%[18]，低于我国华东地区的11.6%和台湾地区的31.0%[17,19]。9株为gyrA与gyrB基因联合突变，其中Asp94Gly+Ala504Thr、Asp94Gly+Ala504Val显示为高水平耐药。

94株FQs耐药株中有12株未发现gyrA或(和)gyrB基因突变，提示其他耐药机制的存在，如gyrA/gyrB基因QRDR以外区域的突变、细胞壁渗透性降低和药物外排泵等。关于10株gyrA基因突变及6株gyrB基因突变但对FQs不耐药的菌株，其MIC水平多处于关键浓度值及其以下2个浓度，可能存在药敏试验结果判读误差或其他引起不准确的因素。

重庆地区MDR-TB菌株中，北京基因型菌株占83.0%，为本地区主要的流行菌株，且以现代型为主，与来自全国及部分省的数据一致[20-22]。在FQs耐药株中，现代北京型的gyrB基因突变率明显低于古代北京型和非北京型，提示现代北京基因型菌株可能相对不易发生gyrB基因突变，由于本地现代北京基因型菌株占多数，所以由gyrB基因突变可能导致的耐药在本地FQs耐药中并不起主要作用。

总之，本研究表明重庆地区MDR结核分枝杆菌对FQs药物耐药的情况不容乐观，新一代FQs药物的耐药性相对较低，应尽快开展新一代FQs药物的药敏试验。同时，应针对常见耐药突变位点，建立适合本地区的对FQs耐药的快速检测方法，尽早为合理使用FQs药物治疗MDR-TB提供依据，以控制本地MDR-TB的传播流行。