抗鸡致病性大肠埃希菌复方中草药超微粉的急性与亚慢性毒性试验

张召兴，闫艳娟，李佩国，李蕴玉，贾青辉，张香斋

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066604)

鸡致病性大肠埃希菌(E.coli)可以通过多种途径感染不同日龄、品种的鸡，引发鸡的急性败血症、肝周炎等多种症状，具有很高的感染率和病死率，致病性E.coli血清型众多复杂，不同的区域流行的血清型不同，其致病性也存在差异，鸡致病性E.coli具有易产生耐药性特点，不易控制，是影响养鸡业发展的主要细菌性疾病[1-2]。根据单味中草药对鸡致病性E.coli地方流行株体外抑菌试验结果，鸡致病性大肠杆菌病的中兽医理论辨证理论观点及各种单味中草药药理作用，并与现在化中草药超微粉技术结合，筛选出了能有效防治鸡致病性E.coli复方中草药超微粉。急性、亚慢性毒性试验是用来评价药物使用安全性，被广泛应用新的药物的研发和安全性评价[3]。急性毒性试验是验证药物在短期内对试验动物的毒性，对试验动物1次或者24 h内多次给药；亚慢性毒性试验是评价药物对实验动物长期使用毒性作用[4-5]。

本试验对筛选出来的抗鸡致病性E.coli复方中草药超微粉通过急性、亚慢性毒性试验进一步评价复方中草药超微粉使用的安全性，为复方中草药超微粉防治鸡致病性E.coli临床的安全使用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用药物 黄连、甘草、当归、神曲等单味中草药,秦皇岛民乐医药有限公司产品。

1.1.2 试验用动物 1日龄的健康海兰灰雏鸡共240只，购于秦皇岛市金牧种鸡场，用无抗生素的全价日粮饲喂至14日龄。

1.1.3 主要仪器和试剂 DHP-9082型隔水式恒温培养箱，上海一恒科技仪器有限公司生产；5804R型台式高容量离心机，德国Eppendor公司产品；ND2000C型超微量分光光度计，德国Thermo公司产品；Infinite M200PRO型酶标仪，Tecan公司产品；谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA) ，南京建成生物工程公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药物的制备 按照比例组合后制成超微粉，将制备的复方中草药超微粉用灭菌水制成混悬液，使之浓度为500 mg/mL。

1.2.2 复方中草药超微粉对雏鸡的急性毒性试验 参照文献[6]，将14日龄质量在85 g±2 g的90只雏鸡平均分成9组，B组～G组给药剂量分别为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 g/(kg·d)，A组给予等量的生理盐水，连续观察7 d，记录中毒时间、症状及死亡数量，计算LD50。试验结束对雏鸡处死，记录病变情况。

1.2.3 复方中草药超微粉对雏鸡的最大耐受量试验 参照文献[6-7]，选择14日龄体重为85 g±2 g雏鸡40只平均分成4组，B组～D组给药剂量分别为5、15、25 g/(kg·d) ，A组为对照组给予等量的生理盐水，观察7 d，记录中毒时间、症状及死亡数量，并对中毒的雏鸡进行剖检，记录病变情况。试验结束将雏鸡处死，采集肝、肾等器官做组织病理学观察。

1.2.4 复方中草药超微粉对雏鸡的亚慢性毒性试验 选择14日龄体质量相近的雏鸡80只，平均分成4组。A组为对照组饲喂基础日粮，B组～D组在基础日粮添加20、40、80 g/kg的复方中草药超微粉至42日龄。在试验期间，记录中毒时间、症状及死亡数量，并对中毒的雏鸡进行剖检，记录病变情况。给药后的14 d和28 d进行称重，并随机抽取5只雏鸡采血后剖检，以检测肝、肾功能指标和肝、肾等器官组织病理学变化。各组余下的雏鸡停药后继续观察14 d，进行称重。

2 结果

2.1 复方中草药超微粉对雏鸡的急性毒性试验结果

在试验过程中，试验鸡的饮水与采食正常，未出现中毒及死亡情况，故计算不出复方中草药超微粉对雏鸡的LD50。试验结束后对鸡剖检，其肝、肾等主要的器官也未出现病变。

2.2 复方中草药超微粉对雏鸡的最大耐受量试验结果

当试验雏鸡最大的给药量为25 g/(kg·d)时，试验鸡饮水与采食正常，未见其他异常表现和死亡情况。剖检和病理组织学观察，未见肝、肾等主要器官出现病变。

2.3 复方中草药超微粉对雏鸡的亚慢性试验结果

2.3.1 临床表现和病理观察结果 亚慢性毒性试验结果表明，各组雏鸡未发生死亡，饮水与采食正常，未见其他异常情况。各组雏鸡的肝、肾等主要器官未出现病变，其病理组织学观察也未见异常变化。

2.3.2 各组雏鸡体质量变化结果 由表1可见，随中药超微粉浓度的增加，体质量呈下降趋势，其中在试验后的第14天，20 g/kg组与对照组比较差异不显著(P>0.05)，40 g/kg，80 g/kg添加组与对照组比较差异显著(P<0.05)。至试验的28 d和停药后的14 d，20、40、80 g/kg添加组与对照组之间的差异不显著(P>0.05)。

2.3.3 各组雏鸡肝肾功能指标检测结果 由表2可知，在试验后的14 d和8 d，20、40、80 g/kg添加组雏鸡血清中的GPT的含量与对照组比较差异不显著(P>0.05)。

表1 复方中草药超微粉对雏鸡体质量的影响

注：同列数据相同小写字母或者无字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters or without letter mean no significant difference in the same column (P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2 不同浓度的复方中草药超微粉对雏鸡血清中GPT、GOT含量的影响

注：同列数据相同小写字母或者无字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters or without letter mean no significant difference in the same column (P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

由表3可知，在试验后的14 d和28 d，随复方中草药超微粉浓度的增加，血清中的BUN含量呈下降趋势，其中40 g/kg，80 g/kg添加组与20 g/kg添加组和对照组相比，差异显著(P<0.05)。20、40、80 g/kg添加组雏鸡血清中的UA的含量均显著低于对照组(P<0.05)，但20、40、80 g/kg添加组之间差异不显著(P>0.05)。

表3 不同浓度的复方中草药超微粉对雏鸡血清中BUN、UA含量的影响

注：同列数据相同小写字母或者无字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters or without letter mean no significant difference in the same column (P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

3 讨论

3.1 复方中草药超微粉对雏鸡的急性毒性试验

急性毒性试验是对受试动物在24 h内1次或者多次给药，验证其药物在短期内对受试动物的毒性。本试验用防治鸡致病性E.coli复方中草药超微粉，对该药物的最终的使用动物(雏鸡)进行了急性毒性试验，更准确评价防治鸡致病性E.coli复方中草药超微粉对雏鸡使用安全性。结果未检测出复方中草药超微粉对雏鸡的LD50，因此，用复方中草药超微粉对雏鸡进行了最大耐受量试验，结果表明，当试验雏鸡最大的给药量为25 g/(kg·d)时，试验雏鸡未出现死亡情况，饮水与采食正常；剖检后观察各个试验组雏鸡的肝、肾等主要器官未出现病变，病理组织学观察也无异常变化，因此，雏鸡对复方中草药超微粉对最大耐受量超过25 g/(kg·d)[相当于复方中草药生药量25 g/(kg·d)]。

3.2 复方中草药超微粉对雏鸡的亚慢性毒性试验

在雏鸡的亚慢性毒性试验中，各个试验组的雏鸡未出现死亡情况，饮水与采食正常，未见其他异常情况，剖检与病理组织学检查也未见异常。40 g/kg和80 g/kg的复方中草药超微粉添加组的雏鸡在用药后14 d时的体质量显著低于对照组，这可能是复方中草药超微粉味道苦，添加高浓度的复方中草药超微粉对雏鸡的应激比较大，影响了采食量，从而使雏鸡生长缓慢，随着对含不同浓度的复方中草药超微粉饲料的适应，在试验后的28 d及停药后的14 d，雏鸡的体质量增加量逐渐提高，并与对照组比较无显著差异，与李应超等[6]研究酸枣仁对罗曼雏鸡的亚慢性毒性试验结果一致。

血清中的GOT和GPT含量的变化是评价肝脏功能重要指标[8-9]。当动物机体肝脏受到损伤时，导致机体物质代谢异常、紊乱，血清中的GOT和GPT含量增加。雏鸡亚慢性毒性试验结果表明，添加20、40、80 g/kg复方中草药超微粉后14 d和28 d的血清中的GPT和GOT含量与对照组比较均差异不显著，从而证实复方中草药超微粉对雏鸡的肝脏无损伤作用，与官丽辉等[9]、索朗扎西等[10]报道的一致。肾脏是动物机体物质代谢产物的主要的排泄器官，其中，尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)是动物体物质代谢主要的产物，也是反映肾功能主要的指标[11-12]。在雏鸡的亚慢性毒性试验中，试验组的雏鸡血清中的BUN、UA含量低于对照组，证实了复方中草药超微能提高雏鸡的肾脏的代谢水平，减少对肾脏的损伤。与张召兴等[12]，张立永等[13]报道的一致。

急性毒性试验结果显示，复方中草药超微粉对雏鸡是无急性毒副作用，最大耐受量超过25 g/(kg·d)，亚慢性毒性试验结果显示，复方中草药超微粉对雏鸡临床上连续服用是安全的。