12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

曹梦蕊，李荣旭，谭华龙，陈济铛，张溢珊，刘敏芳，陈建红，张济培

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副黏病毒科副黏病毒属，3′-NP-P-M-F-HN-L-5′构成其基因组，共编码6种蛋白[1]。其中F蛋白和HN蛋白为NDV的囊膜蛋白，在病毒感染宿主细胞和识别受体的过程中起到重要作用，同时与NDV的抗原性和免疫原性相关[2-3]。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的禽呼吸道、消化道黏膜严重出血的一种传染病，是养禽业极为重视的传染病之一[4-5]。据报道，我国家禽感染NDV的病例报道越来越多，不仅表现在鸡群的感染情况，且水禽感染NDV的发病率、病死率逐渐升高，并以逐年增加的趋势向全国大部分地区蔓延[6-8]。本研究旨在对分离获得的12株NDV的F基因和HN基因进行分子遗传进化分析，从而了解广东部分地区NDV遗传进化情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 12株NDV由佛山科学技术学院禽病研究所分离、鉴定和保存，各毒株具体信息见表1。

1.1.2 引物设计 参考GenBank中的NDV全基因组序列，用Primer 5.0软件设计扩增F基因和HN基因的引物。本试验2对引物分别扩增出大小为2 653 bp和2 100 bp的2个片段，片段序列分别包含了F基因与HN基因开放阅读框。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取和RT-PCR扩增 12株病毒总RNA抽提严格按照TransZol Up Plus RNA Kit说明书进行，并按照反转录试剂盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)的使用说明书进行反转录，其产物进行各毒株F基因和HN基因的PCR扩增，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测分析。

1.2.2 序列测定及同源性分析 选取PCR扩增阳性产物回收纯化，与pMD18 T-Vector 16℃连接4 h，连接产物转化到感受态细胞中，于含有氨苄西林的LB固体培养基37℃培养12 h，挑取克隆菌落在37℃振荡培养，并进行PCR扩增鉴定，将鉴定为阳性的重组菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并与GenBank上已发表的参考毒株的F基因和HN基因序列进行比对分析，并根据F基因核苷酸序列绘制遗产进化树。

表1 12株毒株的来源及分离时间

2 结果

2.1 F基因与HN基因的PCR扩增结果

经RT-PCR扩增后，凝胶电泳结果显示，12个毒株F基因与HN基因均扩增出约为2 653 bp和2 100 bp的条带，与预期目的片段大小一致(图1和图2)。

M.DNA标准DL 5 000；1～12.分离株的F基因PCR结果；13.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000；1-12.F gene PCR results of isolates;13.Negative control

图1 F基因的PCR产物凝胶电泳图

Fig.1 PCR product gel electrophoresis of F gene

M.DNA标准DL 5 000；1～12.分离株的HN基因PCR结果；13.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000；1-12.HN gene PCR results of isolates; 13.Negative control

图2 HN基因的PCR产物凝胶电泳图

Fig.2 PCR product gel electrophoresis of HN gene

2.2 F基因与HN基因序列同源性分析

2.2.1 F基因序列同源性分析 根据本文12株NDV的F基因测序结果，应用生物学软件DNA Star-Megalign，将12个毒株与GenBank的参考毒株F基因核苷酸序列进行同源性比对分析。结果表明，5个鹅源毒株和鸭源MDK/MM-GZ/884/2016株间的核苷酸同源性均高于98%，而与GenBank中公布的基因Ⅶ型的Muscovy duck-China-Fujian-FP1-2002的核苷酸序列同源性仅在88.9%～90.4%之间。鸭源MDK/FS-SS/485/2014株和鸡源CK/FS-SS/N/1997株与国内标准强毒株F48E8核苷酸同源性分别为99.7%和99.5%。鸽源PG/GZ-HD/PN/2011株与鸽源PigeonChina11008、PigeonChina11208、PPMV-1pigeon-IE-806-04、strain1.3参考毒株的核苷酸序列比对同源性在90%左右。本试验12个毒株与疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30同源性在81.6%～91.5%之间。由F基因核苷酸序列分析可见，目前使用的疫苗株与近期流行的NDV的核苷酸同源性存在较大的差异，具体结果见图3。

2.2.2 HN基因序列同源性分析 应用分子生物学软件DNA Star-Megalign，将12个毒株的HN基因测序结果与GenBank参考毒株的HN基因核苷酸序列进行同源性比对分析。结果显示，本实验室分离得到的5个鹅源毒株和鸭源MDK/MM-GZ/884/2016株间的HN基因核苷酸序列同源性高于97%，与Muscovy duck-China-Fujian-FP1-2002参考毒株间的同源性在88.7%～89.4%之间。鸭源MDK/FS-SS/485/2014株和鸡源CK/FS-SS/N/1997株与国内标准强毒株F48E8核苷酸序列同源性分别为99.7%和99.6%。本试验鸽源PG/GZ-HD/PN/2011株与基因Ⅵ型鸽源的NDV的同源性为90.2%～91.5%。12个毒株与疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的HN基因核苷酸序列同源性在80.9%～91.9%之间，详细结果见图4。

图3 12株毒株与参考毒株的F基因核苷酸序列同源性比较

图4 12株毒株与参考毒株的HN基因核苷酸序列同源性比较

2.3 F基因和HN基因推导的氨基酸序列分析

2.3.1 F基因推导的氨基酸序列分析 根据测定的F基因序列推导的F蛋白共编码553个氨基酸残基，12个毒株的F基因裂解区域第112-117位氨基酸残基均为112RRQKRF117，符合NDV强毒株裂解区域的氨基酸序列特征。F基因7个中和位点分别位于第72、74、75、78、79、157-171和343位氨基酸残基，其中9株毒株的第170位均出现D→N的变异。

2.3.2 HN基因推导的氨基酸序列分析 12个毒株HN基因共编码571个氨基酸残基，均含有13个完全保守的半胱氨酸残基，与目前报道的NDV的半胱氨酸残基位点一致。10个分离株的HN蛋白第514位氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异；2011年后分离的7个毒株中的6个在第347位氨基酸残基出现E→D的变异。各区域相关氨基酸残基序列与参考株相比均有不同程度的变异，各区域位点的氨基酸残基变异情况比较见表2。

2.4 F基因的遗传进化分析

根据从GenBank下载的43个参考毒株(包括Class Ⅰ 6个毒株和Class Ⅱ 9个基因型的37个毒株)和本实验室分离的12个毒株的F基因的编码区第47-420位核苷酸序列，应用分子生物学软件DNA Star和MEGA 5.0绘制遗传进化树(图5)。12个分离株均属ClassⅡ，其中9个毒株属于基因Ⅶ型，包括5株鹅源毒株、3株鸭源和鸡源CK/YF-LD/L/1997株。鸭源MDK/FS-SS/485/2014株和鸡源CK/FS-SS/N/1997株属于基因Ⅸ型。鸽源PG/GZ-HD/PN/2011株属于基因Ⅵ型，与目前鸽源NDV的流行基因型一致。

3 讨论

本试验结果表明，广东地区流行的NDV以基因Ⅶ型为主，这与Liu H等[9]的研究结果相一致。该基因型的毒株对易感禽种类和地域没有明显的选择性，同种基因型毒株之间F基因和HN基因变异随机性较大，水禽感染基因Ⅶ病毒的机率明显增加，而同时在禽群中又伴随有Ⅸ型等其他基因型散发[10-13]。12个分离株的F基因和HN基因序列同源性分析显示，12个分离株之间的同源性差异较大，2个鸡源毒株的F基因和HN基因间的同源性低于87%，4个鸭源毒株间F基因和HN基因间的同源性在83.5%～99.8%之间，但5个鹅源间的F基因和HN基因间的同源性高于97.4%；在不同种易感禽类之间，1个鸡源毒株、3个鸭源毒株和5个鹅源毒株均属基因Ⅶ型，其中鸡源毒株与3个鸭源毒株的同源性在90%～96.3%之间，鸡源毒株与5个鹅源毒株的同源性在90%～90.9%之间，3个鸭源毒株与5个鹅源毒株的同源性在89.7%～99%之间。可见分离株的F基因和HN存在遗传变异多样性，可能与广东的养殖区域和养殖模式有关。

12个毒株的F蛋白裂解区域氨基酸序列均为112RRQKRF117，HN基因共编码571个氨基酸残基，符合NDV强毒株的特征[14-15]。12个分离株的F基因和HN基因推导的氨基酸序列分析发现，9个毒株在F基因编码的氨基酸的第170位氨基酸残基出现D→N的变异,10个毒株的HN基因编码的氨基酸第514氨基酸残基出现I→V的变异，据研究报道，HN 蛋白中和表位的氨基酸突变会影响抗原表位的形成，导致病毒粒子更容易逃避宿主的免疫防御系统[16]。

本研究12个分离株中，9个属于基因Ⅶ型，2个属于基因Ⅸ型，1个属于基因Ⅵ型，然而目前我国用于防控新城疫的疫苗株La Sota、Clone30、B1属于基因Ⅱ型，Mukteswar 属于基因 Ш型。由此可见，疫苗株与分离株之间存在一定的抗原差异性，这种差异性可能导致疫苗免疫保护率不高而发生疫病的流行，因此，应加强对新城疫野毒株分子遗传的演变的监控，为更好地筛选出疫苗候选株奠定基础。

●.本试验毒株●.The strain tested