猪流产衣原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

周丹娜，李文浩，阮 征,刘 威，郭 锐，杨克礼,段正赢,袁芳艳,刘泽文,陈文杰，孟 丽，焦祖武*，田永祥*

(1.农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室,湖北武汉 430064；2.湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064；3.武汉市动物疫病预防控制中心,湖北武汉 430016)

流产衣原体(Chlamydophilaabortus,C.abortus)是一种专性细胞内寄生的人兽共患病病原微生物，可以导致宿主的结膜炎、肺炎、关节炎及肠炎等疾病，孕妇和怀孕母畜都十分容易被感染并引起流产或发生死胎[1]。流产衣原体不仅对人类的生命带来了严重的威胁，而且还给畜牧养殖业造成了巨大的经济危害[2]。对全国不同地区的猪场进行血清学调查研究，发现猪流产衣原体血清抗体阳性检出率普遍偏高[3]。使用传统的方法进行C.abortus的检测比较繁琐，而且极易造成污染导致结果无效或虚假阴阳性，难以满足临床检测需要。聚合酶链反应(PCR)技术的成熟，诸如RT-PCR、套式PCR、双重PCR等多种方法被广泛应用于衣原体的病原检测，提高了衣原体检测的准确性和敏感性，但难以进行实时监控及定量分析。本研究构建C.abortusmomp基因的重组质粒为标准品，通过软件进行基因编码序列分析并设计特异性引物和分子信标探针(5′-FAM、3′-Dabycl)，通过优化反应条件和反应体系，拟建立C.abortus实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株、病毒C.abortusHB1043株、E.coliDH5α、Mycoplasma、C.suis、C.pneumoniae、PRRSV基因组，均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保藏。

1.1.2 主要试剂与仪器 AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒，爱思进(杭州)生物技术有限公司产品； MiniBEST universal genomic DNA extraction kit ver.5.0试剂盒、pMD18-T载体、限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ、10×T buffer、rTaq酶、dNTP Mix、DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司产品；2×Phanta EVO HS Master Mix高保真酶、2×TaqMaster Mix PCR预混液，诺唯赞生物科技有限公司产品；高纯度质粒小提试剂盒，康为世纪生物科技有限公司产品；GeneCopoeia All-in-OneTMqPCR Mix，复能基因生物科技有限公司产品；STEPONE plus荧光定量PCR仪、Stepone2.2软件，美国LIFE科技公司产品。

1.1.3 引物探针的设计 根据GenBank数据库登录的C.abortusHB1043株momp全基因序列(JN411078)，利用DNA Man 8.0和Oligo7.0软件设计特异性引物和探针(表1)，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物和探针信息

1.2 方法

1.2.1 猪流产衣原体阳性质粒标准品的构建 使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒从C.abortusHB1043株阳性卵黄膜液中抽提其DNA，以其为模板，利用ecp-momp和ecp-momp2引物[4]，进行C.abortusmomp基因全长的扩增，回收扩增产物，连接到pMD18-T隆载体上并转化至E.coliDH5α，用含有氨苄青霉素抗性的LA固体培养基培养，菌液PCR筛选阳性克隆，并由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序鉴定。提取阳鉴定无误的阳性质粒，利用紫外分光光度计测其浓度和纯度，计算出质粒DNA的拷贝数。

1.2.2 实时荧光定量PCR反应条件和反应体系的确立 以构建的MOMP-T阳性质粒进行实时荧光定量PCR扩增，反应中将探针浓度分别设置为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L 7个梯度进行优化，确定探针最佳反应浓度后，在引物优化反应中所采取的引物浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20 、0.25 、0.30、0.35 μmol/L 7个浓度，确定好引物及探针的最佳反应浓度后，进行Tm值优化，选取温度梯度范围为50.0、51.1、52.8、55.3、58.9、61.5、63.1、64.0℃共8个梯度。通过确立最佳反应浓度和反应条件以达到最佳扩增效率。

1.2.3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 选取阳性质粒标准品进行8个梯度的倍比稀释，从1×100拷贝/μL ～1×107拷贝/μL，分别进行实时荧光定量PCR的扩增，记录Ct值和循环数，通过计算以Ct值为横坐标，拷贝数的对数值为纵坐标作散点图，得到标准曲线，计算相关系数R和扩增效率，建立标准曲线的方程式。

1.2.4 实时荧光定量PCR特异性试验 利用优化后的反应体系和反应条件进行特异性试验。选用模板分别是流产衣原体DNA、MOMP-T质粒、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及日本脑炎病毒(JEV)的核酸进行特异性试验，同时各设置1孔阴性对照和空白对照。根据PCR反应曲线和Ct值确定该检测方法的特异性。

1.2.5 实时荧光定量PCR灵敏度试验 使用分光光度计对衣原体重组质粒的阳性标准品进行浓度的测定，同时结合OD 260 nm/OD 280nm比值，计算质粒的拷贝数，其计算公式：阳性重组质粒拷贝数(拷贝/μL)=(6.02×1023×稀释倍数×质粒浓度×10-9)/(660 Da×质粒碱基长度)。经计算将阳性质粒浓度为进行1.0×1012拷贝/μL 10倍稀释(1.0×1012-1.0拷贝/μL)进行实时荧光定量PCR，以Ct值<35为下限判定其灵敏度。

1.2.6 实时荧光定量PCR重复性试验 将MOMP-T质粒标准品进行10倍倍比稀释，从1×106拷贝/μL～1×104拷贝/μL，每个梯度重复3次进行重复性试验，通过计算每个稀释度Ct值和拷贝数的标准差(SD)和变异系数(CV)来验证该方法的批内重复性。在3个不同的时间检测保存于-20℃的3个浓度的MOMP-T质粒样品，来验证模板的稳定性及荧光定量PCR的批间重复性。

1.2.7 临床样品检测 采用本研究建立的方法对2个猪场采集的30份样品提取核酸进行检测，并对real-time PCR检测为阳性的样品进行16 S/23 S rRNA扩增及测序[5]，检验该方法的准确性。

2 结果

2.1 阳性标准品的制备结果

用CA-momp-F/R引物对MOMP-T进行普通PCR扩增，结果扩增片段与预测的目的片段大小251 bp相一致(图1)，初步判定重组的质粒是阳性。将C.abortus质粒MOMP-T的测序结果分别与GenBank中已登录的momp基因序列比对，BLAST结果显示，C.abortus的质粒MOMP-T序列与GenBank中登录的序列同源性为94%。纯化后的质粒DNA浓度为1.0×1012拷贝/μL，OD 260 nm/OD 280nm为1.96。说明构建的C.abortus阳性质粒的纯度比较高，能满足试验检测要求。将其稀释成1×100拷贝/μL ～1×107拷贝/μL作为标准品。

2.2 实时荧光定量PCR反应条件和体系的确立

通过动力学曲线和扩增效率判断优化的结果，最终反应体系为20 μL，包括2×OneTMqPCR Mix 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、探针(10 μmol/L)0.2 μL、灭菌去离子水7.8 μL、模板1 μL；其反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55.3℃ 20 s，共40个循环；4℃结束反应。

M.DNA标准DL 2 000；1.MOMP-T质粒；2.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000；1.MOMP-T；2.Negative control

2.3 荧光定量PCR标准曲线构建结果

将流产衣原体阳性质粒标准品进行10倍倍比稀释8个梯度100～107拷贝/μL，使用本试验所建立的荧光定量PCR方法进行扩增，以Ct值为横坐标，拷贝数的对数值为纵坐标，绘制稀释后拷贝数100拷贝/μL～107拷贝/μL对应的标准曲线(图2)，R=0.993 2，方程式为y=-0.289 4x+12.762，扩增效率为94.7%。由此可见本检测体系的标准曲线扩增效率高,荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间相关性好,准确性高。

2.4 实时荧光定量PCR特异性试验结果

C.abortus特异性试验鉴定所使用的DNA有流产衣原体、阳性重组质粒标准品MOMP-T、猪肺炎支原体、猪衣原体、肺炎衣原体和猪蓝耳病病毒。经过荧光定量PCR扩增后，结果仅C.abortus的DNA和阳性重组质粒标准品MOMP-T DNA有扩增曲线，其余均没有扩增曲线(图3)，表明该检测方法良好的特异性。

2.5 实时荧光定量PCR灵敏度试验结果

将MOMP-T质粒进行10倍倍比梯度稀释，应用优化后的各条件所建立的方法进行灵敏度试验，结果显示C.abortus实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度为1.0拷贝/μL(图4)，由于嗜衣原体基因组内的MOMP基因是单拷贝基因[4]，因此衣原体模板的分子数可推算为10 fg DNA相当于1个拷贝的基因[6]，证明方法具有较高的敏感性。

1.流产衣原体；2.阳性质粒对照；3.支原体；4.猪衣原体；5.肺炎衣原体；6.蓝耳病毒；7.阴性对照；8.空白对照

1.C.abortu；2.C.abortuMOMP-T；3.Mycoplasma；4.C.suis；5.C.pneumoniae；6.PRRSV；7.Negative control；8.Blank control

图3实时荧光定量PCR特异性试验结果

Fig.3 Specificity test results of real-time PCR

1～12.1.0×1012拷贝/μL～1.0×100拷贝/μL；13.阴性对照；14.空白对照

1-12. 1.0×1012copies/μL-1.0×100copies/μL，respectively；13.Negative control；14.Blank control

图4实时荧光定量PCR灵敏度试验结果

Fig.4 Sensitivity test results of real-time PCR

2.6 实时荧光定量PCR重复性试验结果

将MOMP-T质粒标准品进行10倍倍比稀释，选取浓度范围在109拷贝/μL～107拷贝/μL这3个稀释梯度的质粒，每个梯度的阳性质粒标准品重复n(n≥3)次数进行重复性试验。其结果显示其批內与批间的变异系数为0.022%～0.051%(表2)，说明所建立的检测体系稳定，具有良好的重复性。

2.7 临床样品检测结果

应用建立的方法对30份临床样品进行检测，结果显示，检出流产衣原体6份，阳性检出率20%，将检出的阳性样品进行16 S/23 S rRNA扩增及测序，BLAST结果显示6份阳性样品中的病原与猪源流产衣原体同源性为100%。

表2 实时荧光定量PCR重复性试验结果

3 讨论

最新的分类方法将衣原体目(Chlamydiales)下设8个科、11个属，其中与人或动物衣原体病相关的衣原体主要归类到衣原体科(Chlamydiaceae)，该科有一个衣原体属(Chlamydia)，包含了12个衣原体种，C.abortus就是其中一种[7-8]。流产衣原体宿主范围广，可造成猪、马、牛、羊等家畜的流产、肺炎和关节炎等疾病，并可由动物传染给人，导致严重的人兽共患疫病[9]。由于衣原体常与其他病原混合感染，并未引起足够的关注，血清学调查显示，不同动物衣原体阳性率在26.12%～35.41%，是某些地区山羊等家畜流产的主要原因之一[10-12]。因此，建立一种准确、快速的诊断方法是控制该病的关键。

早期人们对衣原体的研究都是通过简单的显微镜镜检等灵敏度不高的传统方法，随着科学仪器不断更新，PCR为基础的各种病原检测方法得到了越来越广泛的应用。流产衣原体实时荧光定量PCR检测方法的建立，首先是要对流产衣原体的保守基因编码序列区域进行比对分析，然后确定特异性引物和对应特异性探针的最佳保守结合位点，16 S rRNA因其保守性极佳，是理想的目的基因，但很难区分猪流产衣原体和其他衣原体，特别是鹦鹉热衣原体。欧洲不同国家C.abortus分离株基因组进化分析结果显示，其基因多样性要远低于其他种属内，并具有很强的地理特征[12]。momp基因保守且属间特异性强，可用于不同属衣原体的鉴别诊断[13]。因此，本研究选取momp基因建立了猪流产衣原体的实时荧光定量PCR检测方法，与袁曾壮[14]、冯悦等[15]建立的衣原体TaqMan-MGB探针荧光定量PCR相比，本研究建立的检测方法线性相关系数R2和扩增效率略低于MGB探针，但变异系数范围比较小，综合比对数据结果显示，本研究建立的分子信标方法重复性和稳定性较高，特异性好，分子标记探针成本较MGB探针相对便宜，具有很好的应用前景。