2株兼具除臭功能的纤维素降解细菌的分离鉴定

杨井泉，张云峰，高 磊，沈 敏

(新疆农垦科学院 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000)

随着我国畜禽养殖业的迅速发展，畜禽粪便排放不断增加，由此产生的生态环境问题也变得日益突出。目前我国每年产生畜禽粪便排放总量高达38亿吨，而综合利用率和无害化处置率只有分别不到60%和50%[1]，仍有40%未得到有效处理和利用，给周边环境和居民生活带来不利的影响，已成为农业面源污染的主要来源。畜禽粪便富含纤维素、粗蛋白等有机质和一定的矿物质和微量元素，可作为生产有机肥料的原料[2]。

生物堆肥是养殖场固体废弃物资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、可以使大量有机固体废弃物重复资源化利用等优点，但存在发酵周期长、产生臭味、纤维素木质素等分解不彻底、肥效低等缺陷[3]。堆肥是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现固体废物资源化、无害化的一个动态过程，微生物在其中发挥了主要作用，是决定堆肥发酵周期长短和臭味大小的关键因素。如果在堆肥基质中添加可加快基质分解速度并能除臭的微生物组合，则既能加快堆肥腐熟进程又能有效地减少臭味的逸出，对于提高堆肥产品质量和控制环境污染具有重要作用[4-6]。

本试验以某生物滤池样品为菌源进行纤维素酶活性测定和除臭试验，分离筛选出有一定除臭功能高效纤维素降解菌株，并对其生理生化特征和分子水平的种属进行鉴定，以期为进一步开发用于养殖废弃物堆肥处理的复合微生物菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌源样品采自某垃圾处理厂生物滤池。标准菌株绿色木霉(40502)由新疆天物生态科技股份有限公司惠赠。

1.2 培养基及试剂

(1)赫奇逊(Hutchinson)氏培养基：用于纤维素降解菌株的富集培养。KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5 g、FeCl30.001 g、CaCl20.1 g，无淀粉滤纸1张剪碎加入，搅拌并定容至1 000 mL，pH7.2左右，121 ℃高压灭菌 15 min。

(2)牛肉膏蛋白胨培养基：用于细菌的分离培养。牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，琼脂15-20 g，加水溶解并定容至1 000 mL，pH7.4～7.6。121 ℃高压灭菌20 min。

(3)羧甲基纤维素钠培养基(CMC-Na培养基)：用于纤维素降解菌的筛选。羧甲基纤维素钠(CMC- Na)20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、酵母膏0.5 g、H2O 1 000 mL，琼脂20 g，pH 7.0～7.2，121 ℃高压灭菌15 min。

(4)发酵培养基：用于测定酶活。麸皮5.0 g，蛋白胨0.5 g，Mandel's无机盐营养液100 mL，121 ℃灭菌20 min。

(5)生孢培养基：蛋白胨1.0 g、酵母膏0.7 g、(NH4)2SO40.2 g、Mg SO4·7H2O 0.2 g、K2HPO41.0 g，琼脂20 g，加H2O至 1 000 mL，pH 7.0～7.2。121 ℃高压灭菌15 min。倾入无菌直形试管制成斜面。

(6)革兰氏碘液：碘化钾2.0 g，碘1.0 g，加蒸馏水300 mL。用于纤维素水解圈的测定。

(7)DNS 试剂(3,5-二硝基水杨酸)、柠檬酸缓冲液、葡萄糖标准溶液等按照QB 2583- 2003标准配制。

(8)NH3选择性培养基：称取蔗糖50.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.5 g、FeSO40.1 g、1%ZnSO45.0 mL、NaCl 2.0 g，加蒸馏水1 000 mL充分溶解后。按照每瓶10 mL的量分装于50 mL三角瓶中，高压灭菌。接菌前每瓶分别加入100 μL氨水，摇匀备用。

(9)Na2S选择性培养基：KH2PO42 g、NH4Cl 0.4 g、Na2CO30.2 g、MgCl2·6H2O 0.2 g，琼脂18 g，加蒸馏水1 000 mL充分溶解，pH 7.0，高压灭菌。待在培养基冷却至40～50 ℃左右，加入10 g硫化钠，迅速混合均匀，倒平板。

1.3 方 法

1.3.1 纤维素降解细菌的分离 称取10 g样品置于无菌三角瓶，加入100 mL生理盐水搅拌均匀后，取5 mL悬液加入盛有 50 mL赫奇逊氏培养基的三角烧瓶，30 ℃、150 rpm条件下培养30 min以进行纤维素降解菌的富集。将富集后的培养液进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的梯度稀释，分别取100 μL稀释液涂布牛肉膏蛋白胨培养基，置于37 ℃恒温培养24 h。挑取形态不同的单菌落分别接种牛肉膏蛋白胨培养基，纯化培养后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 CMC水解圈测定 取分离菌株的液体培养物各5 μL，分别点种CMC培养基，30 ℃恒温倒置培养1 d。取出培养板，加入革兰氏碘液浸染3～5 min。观察菌落周围有无明显水解圈，并测量水解圈直径(H)与菌落直径(C)，计算H/C比值，根据H/C比值大小初步确定分离菌株纤维素酶活力的高低。

1.3.3 分离菌株纤维素酶活力测定 选取H/C比值较大的分离菌株以及标准菌株，分别接种于液体发酵培养基，30 ℃、150 rpm振荡培养4 d，3 000 rpm离心10 min，收集上清液，进行纤维素酶活性测定。测定指标包括：①纤维素酶总活性：采用滤纸酶活性(FPA)检测法；②外切β-1,4-葡萄糖苷酶(简称CBH或C1酶)活性：采用微晶纤维素(MCC)酶活性测定法；③内切β-1,4-葡萄糖苷酶(简称EG或Cx酶)活力检测：采用羧甲基纤维素(CMC)酶活性测定法；④β-葡萄糖苷酶(简称BG)活性：采用Barush和Swiain法[7]，以水杨酸苷作底物。酶活力单位用IU/mL表示，即每mL 酶液在1 min内使底物降解产生1 μmol葡萄糖所需的的酶量。

1.3.4 分离菌株的除臭能力检测

1.3.4.1 氨水和硫化钠利用情况 将分离菌株分别接入加有100 μL氨水的10 mLNH3选择性液体培养基中，用封口膜密封瓶口后，28 ℃、150 rpm震荡培养1 d。观察菌液的变化，菌液混浊说明菌株能够直接利用NH3，菌液保持透明则说明菌株不能直接利用NH3。

将分离菌株分别划线接种于加有硫化钠的选择性固体培养基中，28 ℃培养1 d。观察不同菌株的生长情况，能够生长的菌株说明其具有利用和降解硫的能力。

1.3.4.2 猪粪除臭效果检测 将分离菌株分别接入10 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，28 ℃、150 rpm条件下培养1 d。称取新鲜猪粪50.0 g，装入1 000 mL烧杯中，加入5 mL培养菌液和5 mL无菌水，混合均匀。每个菌株做6个重复，其中3个用于氨气浓度测定，3个用于硫化氢浓度测定。同时设一组只加无菌水的空白对照。在测氨的大烧杯中，放入装有20 mL硼酸溶液的50 mL小烧杯；在测硫化氢的大烧杯中，放入装有20 mL锌铵络盐溶液的50 mL小烧杯。将大烧杯口密封后，室温(25 ℃)放置。5 d后取出小烧杯中的吸收液，通过硼酸吸收凯氏法测定氨气释放量，亚甲基蓝分光光度法测定硫化氢释放量，进一步检测菌株清除NH3和H2S的能力。同时换入新加入20 mL硼酸溶液或锌铵络盐溶液的50 mL小烧杯。如此每隔5 d进行一次测定，到第20 d为止。

1.3.5 筛选菌株菌落形态及生理生化鉴定 根据分离菌株的菌落形态特征及生理生化特征，参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[8]和《常见细菌系统鉴定手册》[9]进行菌种初步鉴定。

将筛选菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养，得到单菌落，观察分离菌株的菌落形态特征，包括菌落形状、大小、颜色、边缘、透明度、表面、隆起形状及培养基颜色变化等。挑取单菌落，进行革兰氏染色、菌体芽孢染色并镜检。

将筛选菌株划线接种于生孢培养基，30 ℃培养4～7 d。常规涂片，革兰氏染色，油镜观察菌体是否形成芽孢。

生理生化鉴定主要进行糖类发酵试验和碳源利用试验。

1.3.6 筛选菌株的16S rDNA 序列鉴定 提取分离细菌的基因组总DNA，扩增16S rDNA的V3-V4区保守序列，PCR上下游引物序列分别为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。 PCR 反应体系为50 μL：DNA模板15 ng，上下游引物(10 uM)各2 μL，dNTPs(2.5 mM)4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL，TaKaRa)0.3 μL，ddH2O补充至50 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环30 次；72 ℃ 10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳检测合格后切胶回收，送生工测序。利用DNASTAR 5.0软件分析测序结果，并与GenBank中的相关序列进行Blast比对，初步判定各菌株的种属。

1.3.7 筛选菌株的安全性检验 分别吸取候选菌株的培养菌液0.2 mL，接种1月龄京白小鼠，每株菌液接种3只小鼠。同时设3只对照小鼠。维持正常饲养状态。每天观察并记录小鼠的精神状态以及饮食情况，连续观察5 d。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的初筛结果

菌源样品经过富集培养、菌种分离，共获得38株细菌。利用CMC琼脂培养基和Grans's碘液染色法，对分离菌株进行纤维素酶活性初筛，结果共有21株细菌产生了清晰的水解圈，其水解圈直径与菌落直径比值(H/C比值)介于1.86～5之间，说明这些菌株均能产生一定量的纤维素酶。表1所示为部分纤维素降解菌的初筛结果。由表1知，菌株X-1和X-6的水解圈直径(H)和H/C比值相对较高，提示这两个菌株的纤维素酶降解能力相对较强。

表1 部分纤维素降解菌的初筛结果Table 1 The initial screening results of some cellulose degradation bacteria

2.2 纤维素降解菌纤维素酶活性检测结果

试验进一步对21个初筛菌株的纤维素酶活性进行了测定。部分菌株检测结果如表2所示，其中菌株X-1和X-6的纤维素酶总活性(FPA)及纤维素酶主要组分Cen、Cex、BG的酶活性均高于标准菌株绿色木霉，确定为纤维素酶活性较高的分离菌株。

2.3 分离菌株的除臭能力检测

2.3.1 氨水和硫化钠利用情况 如表3所示，菌株X-1能够在添加硫化钠的培养基中生长，但在添加氨水的培养基中不生长，说明该菌株可以利用硫化钠；菌株X-6能够在添加氨水培养基上生长，而在添加硫化钠的培养基上不生长，说明该菌株可以利用氨水作为氮源；菌株X-2、X-3和X-20对氨水和硫化钠均不能利用。菌株X-1和X-6可利用硫或氮的培养特性提示其在清除NH3和H2S方面可能具有一定作用。

表2 部分菌株的纤维素酶活性检测结果Table 2 Test results of cellulase activity in partial isolated strains IU/mL

表3 部分分离菌株的氨水和硫化钠利用情况Table 3 Utilization of NH3 and Na2S in partial isolated strains

2.3.2 猪粪除臭效果检测结果 如表4所示，2个分离菌株分别对猪粪中的H2S和NH3具有一定的清除能力。菌株X-1对猪粪中的H2S 和NH3均具有较高的清除率，接种20 d后对H2S和NH3的清除率分别达到44.56%和29.13%；菌株X-6则可有效利用NH3，接种20 d后对NH3的清除率达到41.87%，但对H2S没有明显的清除效果。

2.4 菌株X-1、X-6的初步鉴定

2.4.1 菌株的形态特征及生理生化特性 菌株X-1菌落呈乳白色凸起，圆形，不透明，表面光滑，边缘整齐。革兰氏染色呈阳性小杆菌(图1A)；在生孢培养基上培养4 d后，经革兰氏染色、油镜观察，可见有大量芽孢形成(图1B)。芽孢位于菌体中部，呈椭圆形，直径大于菌体直径，使得整个菌体膨胀呈梭形。生化鉴定结果表明，菌株X-1能利用试验所选所有糖类物质。如表5所示，X-1能分解果糖产酸并产气；能分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇、鼠李糖、棉子糖产酸不产气。说明X-1可利用较多糖类物质作为碳源和能源，但分解糖的能力有一定差异。酶类试验结果(表6)表明，菌株X-1产生淀粉酶和过氧化氢酶，不产生脲酶、氧化酶和脂肪酶；不产生明胶酶；接种三糖铁琼脂的斜面和底面都为黄色，说明菌株X-6可产生乳糖，不产生H2S；不产生黑色素；耐盐试验结果表明，菌株X-1可耐受1%氯化钠。

表4 筛选菌株NH3和H2S清除能力检测结果Table 4 Test results of the absorbance of NH3 and H2S in isolated strains

图1 菌株 X-1、X-6的革兰氏染色和芽孢形成结果(100×) A、C：菌株 X-1、X-6在常规培养基上培养4 d后菌落的革兰氏染色结果；B、D：菌株 X-1、X-6在生孢培养基上培养4 d后菌落的革兰氏染色结果，箭头所指为芽孢Fig.1 The results of Gram's stain and spore formation of strains X-1 and X-6 A and C: The results of Gram's stain of colonies of X-1 and X-6 cultivated in routine medium B and D: The results of Gram's stain of colonies of X-1 and X-6 cultivated in sporulation medium for 4 days

菌株X-6菌落呈乳白色凸起，圆形，不透明，表面光滑，边缘整齐。革兰氏染色呈阳性小杆菌(图1C)；在生孢培养基上培养4 d后，经革兰氏染色、油镜观察，可见有大量芽孢形成(图1D)。芽孢位于菌体中部，呈圆柱形，直径小于菌体直径。生化鉴定结果表明，菌株X-6能利用试验所选部分糖类物质作为碳源和能源。如表5所示，X-6能分解葡萄糖、蔗糖和木糖产酸不产气；能轻微利用棉子糖；不能利用果胶、甘露醇、果糖和鼠李糖。酶类试验结果(表6)表明，菌株X-6产生淀粉酶和过氧化氢酶，不产生脲酶、氧化酶、脂肪酶和明胶酶；接种三糖铁琼脂的斜面和底面都为黄色，说明菌株X-1可产生乳糖，不产生H2S；不产生黑色素；耐盐性一般，可耐受1%氯化钠。

2.4.2 筛选菌株的16S rDNA 序列鉴定 以筛选菌株X-1、X-6基因组总DNA为模板，经PCR扩增均获得长度为1 516 bp的DNA片段。 将筛选菌株的测序结果分别输入GenBank数据库进行Blast比对。分析结果表明，菌株X-1的V3-V4区扩增序列与灿烂类芽孢杆菌(Paenibacilluslautusstrain12S5，KM374740.1)相似度为99%，初步确定菌株X-1属于类芽孢杆菌属中的灿烂类芽孢杆菌(Paenibacilluslautus)[8-9]。菌株X-6的V3-V4区扩增序列与烟酸芽胞杆菌(BacillusniacinistrainBM1C4，EU221335)相似度为99%，初步确定菌株X-6属于芽孢杆菌属中的烟酸芽胞杆菌(Bacillusniacini)[8-9]。

2.4.3 筛选菌株的安全性检验 试验小鼠在接种菌株X-1、X-6的培养菌液后，除注射当天表现轻微的应激性沉郁外，后续几天均再无异常表现。接种5 d后，将试验小鼠脱颈致死进行解剖，接种小鼠组织器官未发现如何异常。说明2个分离菌株均为安全菌株。

表5 分离菌株的碳源利用检测结果Table 5 The results of utilization of the carbon sources of the screened strains

表6 分离菌株的生化特征Table 6 The biochemical characteristics of the screened strains

综上所述，试验最终分离筛选出两株具有较高纤维素酶活性和一定除臭功能的环境友好型细菌，根据两个菌株的菌落形态、生理生化特征以及基于16S rDNA序列的分子鉴定结果，初步鉴定菌株X-1属于类芽孢杆菌属中的灿烂类芽孢杆菌(Paenibacilluslautus)，菌株X-6属于芽孢杆菌属中的烟酸芽胞杆菌(Bacillusniacini)。

3 讨 论

有关纤维素降解菌的定性筛选，国内目前主要是利用羧甲基纤维素(CMC)为底物结合0.1%刚果红特异性染色的方法[10-11]。刚果红在CMC培养基上的浸染时间为15～20 min，较为快速。但刚果红是一种联苯胺类染料，存在致癌风险[12]，且对菌株生长和纤维素酶产量有一定影响[13]。2008年，Kasana等[13]首次报道了利用革兰氏碘液染色筛选纤维素降解菌的方法，革兰氏碘液能够与CMC培养基中的纤维素结合形成乌青色的复合物，而与被水解的纤维素则不结合，从而在产纤维素酶菌株菌落周围形成一个颜色差异明显、边缘清晰的水解圈。本试验采用CMC培养基结合革兰氏碘液染色方法，在较短时间内完成了产纤维素酶候选菌株的定性筛选，并根据水解圈直径与菌落直径比值(H/C比值)大小初步筛选出2株纤维素酶产生能力相对较强的菌株。而且从进一步的纤维素酶活性检测数据来看，初筛结果和定量检测结果趋势基本一致，具有很好的参考价值。整个染色过程只需要3～5 min，相对于刚果红染色，该方法更为安全、有效、方便、快捷，值得推广。

试验重点对分离菌株的纤维素酶活性进行了检测，期望得到产酶量高、酶系组成比较齐全的安全菌株。结果表明，分离菌株X-1、X-6的3个主要的纤维素酶组分C1、Cx和BG的酶活都比较高，其中X-1的C1、Cx和BG酶活均在100 IU/mL以上，纤维素酶总活性(FPA)分别为77.97和70.95 IU/mL，纤维素酶活性接近[10，15]或高于[13]部分文献所报道的分离菌株，而低于金迪等[16]的文献报道。另外，从生理生化试验结果来看，两个分离菌株除了高产纤维素酶外，还可产生淀粉酶和过氧化氢酶。纤维素酶和淀粉酶是饲用复合酶制剂的两个重要组分[17]，由于淀粉酶活性不是本次试验关注的重点，因此未做进一步研究。在养殖环境治理过程中，除臭是涉及空气污染的一个重要治理环节。简保全等[18]针对H2S和NH3在粪便堆肥过程中的释放特点进行的研究表明，H2S的产生主要集中在升温期和高温期初期(1～13 d)，NH3的挥发主要集中在升温期和高温期(1～20 d)，即堆肥的前20 d是H2S和NH3的主要释放期。本次分离菌株通过新鲜猪粪除臭试验结果表明，在接种第15～20 d，菌株X-1 和X-6分别对H2S和NH3表现出较好的脱臭功能，是两株兼具纤维素降解和除臭功能的环境友好型细菌。后续将对这两个分离菌株的功能做进一步试验研究，同时继续筛选纤维素降解菌株和除臭菌株，为最终开发复合菌剂，实际应用于养殖废弃物环境污染治理奠定技术基础。