阴道黏膜修复敷料的生物学评价

李晓春 王莉芳 郑 旭 徐长根

陕西省食品药品监督检验研究院，陕西西安 710065

自2014年6月1日起开始施行的《医疗器械监督管理条例》中明确提出国家对医疗器械按照风险程度实行分类管理。 根据2017年8月颁布的医疗器械分类目录[1]，阴道黏膜修复敷料属于无源植入器械中的组织工程支架材料，属Ⅲ类器械，即属具较高风险，需采取特别措施严格控制管理以保证其安全、有效的医疗器械[2]。我们按照GB/T系列标准对阴道黏膜修复敷料进行了细胞毒性、迟发型过敏及刺激等生物学评价，给出其应用于临床的可行性分析，现报道如下。

1 试验材料

1.1 供试品

三个厂家提供的供试品，分别记为1#、2#、3#，均为壳聚糖类修复敷料。

1.2 材料、药品、试剂

高密度聚乙烯：批号：K0M357，美国药典委员会；氯化钠注射液，批号：160130 3G，西安京西双鹤药业有限公司；优级胎牛血清，货号：TBD21HY，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RPMI培养基，批号：AB10125297，HyClone；青链霉素混合液（100×），批号：20170503，Solarbio；胰蛋白酶，批号：SLBP8607V，Sigma；二甲基亚砜（DMSO），批号：20140305，国药集团化学试剂有限公司；噻唑蓝（MTT），批号：MKBN7264V，Sigma。

1.3 细胞及动物

细胞株，L929细胞，武汉博士德生物工程有限公司。

白化豚鼠、雌性白化新西兰兔，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2014-001。饲养环境：温度22～26℃，相对湿度40%～70%，实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2013-001。

1.4 仪器

电子天平，BS2202S，赛多利斯仪器有限公司；生化培养箱，BSP-250，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；低速台式离心机，KA-1000，上海安亭科学仪器厂；医用净化工作台，SW-CJ-2F，苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱，HF151，上海力康医疗设备有限公司；倒置相差显微镜，XSZ-D2，重庆光学仪器厂；酶标仪，Versa Max0310-3264，美国分子仪器有限公司。

2 方法

2.1 迟发型超敏反应封闭贴敷试验[4-6]

健康白化豚鼠共35只，雌雄不限。30只作为试验组，每个样品10只，5只作为对照组。试验前剔除豚鼠背部被毛。

（1）诱导阶段

用吸收性纱布浸透供试品1mL，局部贴敷于每只动物的左上背部位。6h后除去包扎带和纱布。1周中连续3d重复该步骤，同法操作3周。对照组以氯化钠注射液同法操作。

（2）激发阶段

最后一次诱导贴敷后14d，用供试品和氯化钠注射液对全部动物进行激发。方法同（1），贴敷于每只动物去毛的未试部位。6h后除去包扎带和纱布。

（3）动物观察

激发后24h剃去激发部位及其周围的被毛，温水洗净擦干，按表1对试验部位评分，并于48h再次评分。

表1 Magnusson和Kligman分级

2.2 体外细胞毒性试验（MTT法）[3，7-9]

（1）试验样品及试液的制备

供试液：无菌条件下将阴道黏膜修复敷料与含血清培养基按0.2g/mL的比例于37℃浸提24h后2000rpm离心5min，取上清。

阴性对照液：取高密度聚乙烯（厚度为1mm）36cm2，剪成5mm×25mm的小块，加12mL细胞生长培养液，37℃浸提24h，过滤除菌。

阳性对照液：5%的DMSO溶液，过滤除菌，现用现配。

空白对照液：同细胞生长培养液。

（2）方法：将细胞制成密度为1×104个/mL的细胞悬液并接种于96孔板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组，每组各设至少6孔，每孔接种100μL。置CO2培养箱37℃培养24h后，弃去原培养液。各组加入每孔100μL的相应溶液，继续培养72h后显微镜下观察细胞形态，每孔加入20μL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μL的DMSO，酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度，按下式计算相对增值率（RGR）[10]。

RGR=A/A0×100%，式中：

RGR——相对增值率，%；

A——供试品组（阳性及阴性对照组）吸光度；

A0——空白对照组吸光度。

根据RGR按表2分级标准判定。阴性对照组的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反应。

表2 细胞毒性反应分级

2.3 黏膜刺激试验[4，11-12]

选取阴道无明显刺激症状、无缺陷和无损伤的健康雌性家兔12只，体重不低于2kg，供试品组及对照组各3只。供试品组家兔阴道注入1mL供试品，对照组注入等量的氯化钠注射液。每次间隔24h连续重复上述步骤，至少连续5d。末次接触后24h，无痛处死动物，完整切下阴道后纵向切开，检查黏膜组织的刺激、损伤及坏死情况。常规石蜡包埋、切片、HE染色，LEICA生物显微镜观察。按表3规定的记分系统进行评分。试验组动物显微镜评价记分相加后再除以观察总数即得试验组平均记分，对照组同法计算。试验组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数，见表4。

3 结果

3.1 迟发型超敏反应试验结果

供试品组及对照组中豚鼠的反应等级均为0，在本试验条件下，均未观察到三批阴道黏膜修复敷料导致豚鼠出现迟发型超敏反应迹象，结果见表5。

3.2 体外细胞毒性试验结果

结果表明，阳性对照组细胞毒性反应级别为3级，阴性对照组细胞毒性反应级别为0级，试验系统成立。三批阴道黏膜修复敷料的细胞毒性反应级别均不大于2级，在标准可接受范围内[8]。显微镜下各组细胞形态见图1，结果见表6。

表3 口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应显微镜计分系统

表4 刺激指数

表5 迟发型超敏反应试验结果

表6 细胞毒性试验结果

图1 显微镜下各组细胞形态

3.3 黏膜刺激性试验结果

病理检查结果显示：对照组的黏膜层上皮结构完整，固有层可见极少量炎细胞浸润，少数血管充血及极轻度水肿。试验组的黏膜层上皮结构完整，固有层可见极少量炎细胞浸润，轻度血管充血及极轻度水肿。结果表明，三批阴道黏膜修复敷料均具极轻度黏膜刺激，病理切片见图2，计分结果见表7。

表7 阴道黏膜刺激性试验结果

图2 各组病理切片图

4 讨论

阴道黏膜修复敷料的主要成分为壳聚糖，是一种天然的碱性高分子化合物，具有良好的生物相容性、可降解性、吸附性、成膜性[13]，能激活阴道内多种免疫细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的活性[14]，使机体的免疫系统得到恢复和加强，并能通过免疫调节作用发挥多种生理活性，诱导并提高细胞生长因子活性，改善阴道内的生态环境。具优良的抑菌作用，对许多微生物包括细菌和真菌，都有不同程度的抑制作用。同时阴道黏膜修复敷料还有促进阴道内表皮细胞血液凝固的作用，可用作止血剂，保持创面湿润，促进创面愈合[15]，对阴道黏膜的创口、感染、出血等症状产生积极的作用。目前，不少生物技术公司自主研发的阴道黏膜修复敷料进入了上市前评价阶段，但由于生产工艺的改进过程中涉及到生物材料的修饰改性工艺，故急需对其应用于人体的生物安全性进行评价[16]。本文按照GB/T16886及GB/T14233的系列标准，对三批阴道黏膜修复敷料进行了生物安全性评价，结果显示无豚鼠皮肤致敏反应，对家兔阴道黏膜具极轻度刺激，细胞毒性不大于2级，均在标准规定的可接受范围内。初步认为三批阴道黏膜修复敷料毒性较低，有望用于临床。