慢性乙型肝炎病毒携带者细胞免疫功能与中医证型及影响因素相关性研究

严 颖 朱肖鸿 傅淑艳 陈丹丹 凌红羽

作者单位：浙江省中医院下沙院区感染科（杭州 310018）

乙型肝炎病毒感染呈世界性流行，据世卫组织报道，全球约20亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中 2.4 亿为慢性 HBV 感染者[1]，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌[2]，严重威胁人类健康，是一个全球性的健康问题[3]。我国约有1.5亿HBV携带者[4]。HBV感染的扩散主要由无症状携带者所致。宿主的细胞免疫功能状况是影响HBV携带的一个非常重要的因素。研究[5]表明，乙型肝炎病毒感染后HBV特异性T淋巴细胞亚群在对病毒的清除和疾病的转归中起着重要的作用。本研究通过分析四种常见中医证型的患者不同性别、年龄、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus DNA，HBVDNA）载量和乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）水平和 T细胞亚群变化的规律，了解其对T细胞免疫功能的影响，为慢性乙型肝炎病毒携带者的特异性免疫和中医治未病干预治疗提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年7月—2017年10月浙江省中医院肝病门诊就诊，确诊为慢性乙型肝炎病毒携带者110例，男58例，女52例，年龄15～65岁，平均（33.66±9.77）岁。另选择同期体检合格的健康人20名为对照组，其中男12名，女8名，年龄20～59岁，平均（34.20±10.82）岁，均无肝炎病史、乙型肝炎标志物测定阴性，肝功能正常。

1.2 纳入标准 符合《慢性乙型肝炎防治指南》[2]（2015版）中相关标准进行诊断，符合以下两条中的一条即可诊断：（1）慢性HBV携带者：多为年龄较轻的处于免疫耐受期的HBsAg（hepatitis B s antigen，乙型肝炎s抗原）、HBeAg、HBVDNA阳性者，1年内连续3次随访，每次间隔至少3个月，丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）均在正常范围，HBVDNA通常为高水平，肝组织检查无病变或者病变轻。（2）非活动性HBsAg携带者：血清HBsAg阳性、HBeAg阴性，HBVDNA低于检测下限或者＜200IU/mL，1年内连续随访3次及以上，每次至少间隔3个月，ALT均在正常范围内。肝组织学检查提示组织活动指数＜4或根据其他的半定量计分系统判定病变轻微。本研究遵循伦理委员会要求，开展临床研究，所有患者均自愿参加该研究，并签署知情同意书。

1.3 排除标准 （1）合并感染甲、丙、丁、戊型肝炎，和/或感染人类免疫缺陷病毒；（2）有除外病毒性肝炎的慢性肝病史或慢性肝病相关的临床情况（如色素沉着病、自身免疫性肝炎、代谢性肝脏疾病、酒精性肝病、中毒性肝病、地中海贫血等）；（3）入选前的6个月内有服用非法药品史或滥用酒精史（每天饮酒超过30g的女性和男性）；（4）有肝细胞癌、肝硬化或血清甲胎蛋白升高者；（5）有心脑血管等其他严重疾病的证据的；（6）怀孕或哺乳期妇女；⑧有精神疾患者。

1.4 中医辨证标准 参照《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》[6]，由两名具有高级职称的中医师进行中医证候分型。本研究所选慢性乙型肝炎病毒携带者常见四种中医证型为脾气虚证、肝气郁结证、湿热中阻证、肾气虚证。

1.5 研究方法

1.5.1 T淋巴细胞亚群检测 所有受试者采集空腹静脉血5mL，采用流式细胞分析技术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值。

1.5.2 血清乙肝三系检测 采用酶联免疫吸附测定（ELISA） 技术测定 HBsAg、HBeAg、HBeAb（hepatitis B e antibody，乙型肝炎e抗体）滴度，据此将患者分为 HBeAg（+）组和 HBeAg（-）组。

1.5.3 血清HBVDNA检测 采用实时荧光定量PCR检法（FQD-33A型）检测血清HBVDNA载量，操作严格按试剂盒使用说明进行。最低检测下限值为（1.00E+02）IU/mL，结果判断标准：＜102IU/mL 为阴性组，102～105IU/mL 为低载量组，105～107IU/mL 为中载量组，＞107IU/mL为高载量组。

1.5.4 相关分析 分析患者HBeAg、HBVDNA滴度及性别、年龄、中医证型与T淋巴细胞亚群的关系。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数土标准差（±s）表示，多组样本均值用方差分析，计数资料组间比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中医证型分布 本组110例患者常见中医证型为脾气虚证31例（28.18%），肝气郁结证42例（38.18%），湿热中阻证22例（20.00%），肾气虚证15例（13.64%），以气虚证为常见，其次依次为肝气郁结证、湿热中阻证。

2.2 慢性HBV携带者T淋巴细胞亚群检测结果

与健康对照组比较，慢性HBV携带者外周血CD4+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值水平显著降低（P＜0.01）；CD8+T淋巴细胞百分率则显著升高（P＜0.01），见表 1。

表1 慢性HBV携带者外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

表1 慢性HBV携带者外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.01

组别慢性HBV携带组健康对照组例数110 20 CD4+35.41±7.18*46.27±3.29 CD8+24.89±5.50*20.29±1.51 CD4+/CD8+1.52±0.54*2.30±0.27

2.3 不同中医证型外周血T淋巴细胞亚群检测结果

四种证型CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+比值均较健康对照组降低（P＜0.05），依湿热中阻证—肝气郁结证—脾气虚证—肾气虚证顺序，呈逐渐降低趋势；脾气虚证、肾气虚证外周血CD8+T细胞百分率较健康对照组升高（P＜0.05）。脾气虚证和肾气虚证组CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+比值较湿热中阻证组明显降低（P＜0.01）。见表 2。

2.4 慢性HBV携带者不同HBeAg滴度T淋巴细胞亚群检测结果 HBeAg阳性组与HBeAg阴性组比较，患者CD4+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值水平显著降低，CD8+T淋巴细胞百分率则显著升高（P＜0.05）。见表 3。

表2 不同中医证型患者外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

表2 不同中医证型患者外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与湿热中阻证比较，△P＜0.01

中医证型脾气虚肝气郁结湿热中阻肾气虚健康对照组例数31 42 22 15 20 CD4+29.91±2.35*△37.97±1.80*45.38±3.58*24.97±1.26*△46.27±3.29 CD8+26.82±5.08*△23.03±4.01 21.52±3.47 31.07±6.10*△21.29±1.51 CD4+/CD8+1.17±0.3*△1.70±0.31*2.16±0.38*0.84±0.24*△2.30±0.27

表3 慢性HBV携带者不同HBeAg滴度外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

表3 慢性HBV携带者不同HBeAg滴度外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与 HBeAg阴性组比较，▲P＜0.05

组别HBeAg阳性组HBeAg阴性组健康对照组例数27 83 20 CD4+28.66±5.60▲37.60±6.23*46.27±3.29 CD8+29.80±5.73▲23.29±4.39*20.29±1.51 CD4+/CD8+1.04±0.46▲1.68±0.45*2.30±0.27

2.5 不同HBV-DNA载量患者T淋巴细胞亚群比较 HBV-DNA（+）与 HBV-DNA（-）组比较，CD4+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值显著降低，CD8+T淋巴细胞百分率显著升高。随着HBV病毒载量的升高，CD4+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值逐渐下降，CD8+T淋巴细胞百分率逐渐升高（P＜0.05），见表4。

表4 慢性HBV携带者不同HBVDNA载量外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

表4 慢性HBV携带者不同HBVDNA载量外周血T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与阴性组比较，▽P＜0.05；与低载量组比较，▼P＜0.05；结果判断标准：HBVDNA＜102IU/mL 为阴性组，102～105IU/mL为低载量组，105～107IU/mL为中载量组，＞107IU/mL为高载量组

组别健康对照组阴性组低载量组中载量组高载量组例数20 56 31 6 17 CD4+46.27±3.29 38.64±5,18 35.26±7.31*▽29.28±3.18*▽▼27.18±5.78*▽▼CD8+20.29±1.51 21.89±3.64 25.93±4.42*▽30.04±5.99*▽▼31.06±5.31*▽▼CD4+/CD8+2.30±0.27 1.81±0.39 1.42±0.48*▽1.03±0.35*▽▼0.94±0.47*▽▼

2.6 慢性HBV携带者不同性别T淋巴细胞亚群检测结果 慢性HBV携带者不同性别，男性组与女性组比较，CD4+T淋巴细胞百分率、CD8+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 5。

2.7 慢性HBV携带者不同年龄组T淋巴细胞亚群检测结果 慢性HBV携带者不同年龄组，男性组与女性组比较，CD4+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值，差异无统计学意义（P＞0.05），CD8+T淋巴细胞百分率，≤30岁组明显高于＞30岁组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 6。

表5 慢性HBV携带者不同性别T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

表5 慢性HBV携带者不同性别T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

组别男性组女性组例数58 52 CD4+34.73±7.12 36.16±7.24 CD8+25.42±5.32 24.30±5.68 CD4+/CD8+1.45±0.47 1.61±0.60

表6 慢性HBV携带者不同年龄T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

表6 慢性HBV携带者不同年龄T淋巴细胞亚群检测结果（%，±s）

注：与 31～45岁组、≥46岁组比较，☆P＜0.05

年龄≤30岁31～45 岁≥46岁例数46 51 13 CD4+34.19±7.38 36.24±7.35 36.46±5.43 CD8+26.43±5.63☆24.02±5.26 22.83±4.80 CD4+/CD8+1.39±0.53 1.61±0.55 1.67±0.48

3 讨论

乙型肝炎病毒通过宿主自身免疫反应造成肝细胞的损伤。HBV感染诱导机体形成慢性化感染、持续性耐受和激活特异性免疫应答。研究[7]表明，HBV特异性T淋巴细胞亚群在对病毒的清除和疾病的转归中起着重要的作用。CD4+T淋巴细胞通过辅助体液免疫细胞，产生抗体和细胞毒性杀伤作用来清除HBV，其水平下降是HBV感染慢性化的重要原因。CD8+T淋巴细胞是清除HBV的主要效应T细胞，有直接被HBV感染肝细胞激活的特性，免疫耐受期HBV病毒不断复制，引起CD8+T淋巴细胞的细胞毒作用随病毒水平的增高而增强。二者相互影响，平衡机体免疫状态，当两者数目发生变化时，导致细胞免疫功能下降和免疫调节失衡。慢性HBV感染者体内T淋巴细胞亚群失衡主要由CD8+T淋巴细胞比例升高、CD4+T淋巴细胞比例下降引起，并且和HBVDNA复制有关，HBVDNA复制、高HBeAg表达时可进一步导致乙肝患者细胞免疫功能紊乱[8]。

中医认为，该病形成是由湿热疫毒隐伏，正气不能抗邪所致，属于中医正虚邪不盛。病变不仅涉及肝，且多克脾、累肾[9]。湿热疫毒入侵机体，伤及肝脏，继则肝病传脾，肝脾同病，印证“见肝之病，知肝传脾”的理论。久则病情由实转虚，病位由浅入深，肝肾同源，必将伤肾。本研究四种证候出现在肾、肝、脾三脏，且以气虚证为主，也与其发病机制相吻合。机体的正气与现代医学的免疫系统功能有密切联系，正气不足表现为免疫功能低下或失常。

本研究显示，四种证型携带者CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+比值较健康对照组降低，依湿热中阻证-肝气郁结证-脾气虚证-肾气虚证顺序，呈逐渐降低趋势，提示此四种证型患者均存在一定程度的免疫紊乱或低下。脾气虚证和肾气虚证组较湿热中阻证组CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+比值明显降低，提示气虚证患者细胞免疫功能相对更加低下，故气虚证携带者在临床上治疗时宜重用补脾益肝肾药物，以提高机体免疫功能，促进疾病的恢复[10]。湿热中阻证患者CD4+T细胞百分率和CD4+/CD8+值虽较健康对照组下降不明显，提示该人群正气并未衰败，免疫应答没有明显减弱，正气旺而邪气盛，可能存在炎症反应增强。因此，湿热中阻证人群更容易发生炎症反应，出现肝组织损伤[11]，故在免疫调节治疗基础上应加重清热解毒利湿药物的早期干预。

本研究结果还显示，慢性HBV携带者不同性别，T淋巴细胞亚群检测差异无统计学意义。不同年龄组，≤30岁组患者CD8+T淋巴细胞百分率明显高于＞30岁组（P＜0.05）表明青壮年时期往往处于乙型肝炎病毒感染的免疫耐受期，HBV病毒不断复制、病毒抗原的持续存在导致CD8+T淋巴细胞数量增多。与健康对照组相比，慢性乙型肝炎病毒携带者的CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值明显降低（P＜0.01）。HBVDNA（+）组与 HBVDNA（-）组比较，HBeAg（+）和 HBeAg（-）比较，CD4+T 淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值下降、CD8+T淋巴细胞百分比增高（P＜0.05），提示患者T细胞亚群改变不仅与HBV感染有关，也与HBVDNA复制程度有关。HBVDNA复制增加，可能进一步导致患者细胞免疫功能紊乱。乙型肝炎病毒携带者在长期受到HBV感染的情况下，T淋巴细胞发生免疫耐受或启动凋亡程序,T淋巴细胞的激活变为抑制效应[12]，导致体内细胞免疫功能低下,这也可能是病毒持续存在而导致感染慢性化的原因之一。

综上,慢性乙型肝炎病毒携带者细胞免疫功能发生变化，因此临床上可根据患者不同年龄、HBVDNA载量、HBeAg滴度变化来了解慢性乙型肝炎病毒携带者的免疫功能。通过中医辩证分析，判定当病证由实转虚的过程中，往往会出现细胞免疫功能的紊乱或下降。CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值，可作为判定病情轻重程度的一个重要指标。在临床上，我们可以通过抑制HBV复制、中医扶正祛邪法来改善机体的细胞免疫功能,提高机体对HBV清除的能力，从而遏制疾病的进展。