微小RNA-326靶向CARD10抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭

张茂娜,张 弘,张 雷,孔令非

(1武汉大学人民医院鄂州医院病理科,鄂州 436000;2郑州大学附属河南省人民医院病理科;*通讯作者,E-mail:zmn0306@126.com)

miRNA是一类长度为19-25个核苷酸的非编码单链RNA,通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(UTR)结合,抑制mRNA翻译或直接导致其降解,抑制靶基因表达[1-3]。miR-326的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关[4,5]。本研究以miR-326表达量最低的乳腺癌细胞株为细胞模型,生物信息学方法寻找miR-326的靶基因,并通过实验验证miRNA-mRNA之间的靶向结合关系,以及他们所调控的下游信号通路与乳腺癌增殖、侵袭的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

乳腺癌细胞株MCF7、BT549、MB-MDA-468、HCC1937、SKBR3和人正常乳腺上皮细胞MCF10A购自中国典型培养物保藏中心。miR-326 mimics、miR-NC、CARD10-WT(野生型)和CARD10-MUT(突变体)载体质粒购自广州锐博生物科技有限公司;qPCR试剂盒购于日本TaKaRa公司;qPCR引物购自上海生物工程股份有限公司;RPMI-1640培养基、DMEM培养基、LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;GAPDH、CARD10、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白抗体购自英国Abcam公司(蛋白编号分别为ab8245、ab36839、ab76055、ab18203、ab53519和ab27568)。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 miR-326靶基因预测

本研究选择microRNA.org预测网站预测miR-326可能的靶基因。miR-326与CARD10 mirSVR评分为-0.129 4,PhastCons评分为0.587 3,具体的序列互补区域见图1。

图1 miR-326与CARD10-WT和CARD10-MUT结合预测图Figure 1 The predicted site of miR-326 binding to CARD10-WT and CARD10-MUT

1.3 细胞培养与转染

MCF7、BT549、HCC1937和SKBR3细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,MB-MDA-468和MCF10A细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。转染操作按照LipofectamineTM3000说明书进行,以对数生长期细胞为转染对象,随机将细胞分为阴性对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-326)。转染操作后第48小时进行后续实验。

1.4 qPCR检测细胞中miR-326和CARD10 mRNA的表达

提取各组细胞总RNA,逆转录后进行qPCR检测。miR-326检测以U6为内参,CARD10 mRNA检测以GAPDH为内参。反应体系和条件参照qPCR试剂盒进行操作,Ct值均以2-ΔΔCt分析比较各组miR-326或CARD10 mRNA表达差异。PCR引物见表1。

表1检测miR-326和CARD10mRNA表达的qPCR引物序列

Table1TheqPCRprimersequencesfordetectingmiR-326andCARD10mRNAexpression

基因 引物序列(5'-3')U6上游:TC-CGATCGT-GAAGCGTTC下游:GTG-CAGGGTCCGAG-GTmiR-326上游:GATCCTCT-GGGCCCTTCC下游:CAGTGCGT-GTCGTGGAGTGAPDH上游:CTGGGCTA-CACTGAGCACC下游:AAGTG-GTCGTT-GAGGGCAATGCARD10上游:CTGTGG-GAGCGAATCGAGG下游:CAGCG-CAAGATGTCCAT-CA

1.5 Western blotting检测CARD10及下游蛋白表达

细胞转染后第48小时,加裂解液进行裂解,提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度,蛋白变性后,上样进行聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳,硝酸纤维膜转膜,5%脱脂牛奶室温封闭,适量一抗冰箱内孵育过夜,二抗室温摇床孵育2 h,增强化学发光法定影、观察。

1.6 双荧光素酶报告基因系统检测

细胞分为4组,分别共转染CARD10-WT+miR-NC、CARD10-WT+miR-326、CARD10-MUT+miR-NC和CARD10-MUT+miR-326。用磷酸盐(PBS)缓冲液洗3次,根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书,检测各组细胞荧光酶活性。

1.7 MTT法检测两组细胞增殖能力

收集转染48 h的两组细胞,计数后以4×103个/孔接种96孔板,连续培养1,2,3,4,5 d,于每天的相同时间每孔加入20 μl MTT,培养4 h,吸去上清,每孔加入150 μl二甲基亚砜,振荡10 min。酶标仪检测波长在490 nm处的吸光值。

1.8 Transwell侵袭实验检测两组细胞侵袭能力

使用胰酶消化收集两组细胞后,无血清培养基重悬细胞密度调整为1.5×105个/ml。将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶50 μl(0.2 μg/μl),培养箱内孵育15 min,使胶凝固。细胞按照3×104个/孔加入Transwell上室,同时在Transwell下室加入完全培养基600 μl,放入培养箱培养3 h。甲醛固定,结晶紫染色15 min,棉签轻轻擦拭内膜上的细胞。显微镜下计数4个高倍视野下穿过滤膜的细胞数。

1.9 统计学分析

应用SPSS18.0统计软件分析,实验数据均以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞株和人正常乳腺上皮细胞miR-326表达水平

与人正常乳腺上皮细胞MCF10A相比,乳腺癌细胞株MCF7、BT549、MB-MDA-468、HCC1937、SKBR3中miR-326低表达(P<0.05),BT549细胞表达量最低(P<0.01,见图2)。

与MCF10A细胞相比,*P<0.05,**P<0.01图2 人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞株中miR-326表达水平Figure 2 The miR-326 expression in human normal breast epithelial cells and breast cancer cell lines

2.2 miR-326转染效率测定及各组细胞中CARD10 mRNA的表达

miR-NC组和miR-326组BT549细胞中miR-326相对表达量分别为1.09±0.22和5 893.00±751.60(t=7.84,P<0.01)。miR-NC组和miR-326组BT549细胞中CARD10 mRNA相对表达量分别为1.00±0.04和0.45±0.09(t=5.82,P<0.01,见图3)。与miR-NC组相比,miR-326组细胞中CARD10 mRNA的表达显著下降。

与miR-NC组相比,**P<0.01图3 qPCR检测miR-326对CARD10 mRNA表达的影响Figure 3 Effect of miR-326 on CARD10 mRNA expression by qPCR

2.3 过表达miR-326对靶蛋白表达的影响

Western blotting结果显示,与miR-NC组相比,转染miR-326后,CARD10、N-cadherin、Snail和Slug蛋白的表达水平显著下降,E-cadherin蛋白表达明显上升(见图4)。

图4 Western blotting检测miR-326对下游靶蛋白表达的影响Figure 4 Effect of miR-326 on the downstream target protein expression by Western blotting

2.4 miR-326与CARD10结合位点验证

双荧光素酶报告基因系统显示,miR-326能显著抑制CARD10-WT载体的报告荧光的强度,对将预测的结合部位进行突变处理后,miR-326无法下调CARD10-MUT载体的报告荧光强度(P<0.01,见图5);miR-NC对照组对野生型和突变型细胞均无抑制作用。

1.CARD10-MUT+miR-326;2.CARD10-WT+miR-326;3.CARD10-MUT+miR-NC;4.CARD10-WT+miR-NC;与CARD10-MUT+miR-326相比,**P<0.01图5 双荧光素酶报告基因系统验证miR-326与CARD10之间的靶向结合Figure 5 The dual luciferase reporter system verified the targeted binding between miR-326 and CARD10

2.5 过表达miR-326对细胞增殖的影响

MTT检测结果显示,与对照组相比,miR-326组的细胞从4 d开始,增殖能力明显降低(P<0.05,见图6)。

与miR-NC组相比,*P<0.05图6 miR-326对乳腺癌细胞BT549增殖的影响Figure 6 Effect of miR-326 on proliferation of breast cancer cells BT549

2.6 过表达miR-326对细胞侵袭的影响

miR-NC组和miR-326组BT549细胞侵袭细胞计数分别为176.80±12.78和98.28±14.70(P<0.01,见图7)。与对照组相比,转染miR-326后的乳腺癌细胞侵袭能力明显被抑制。

图7 miR-326对乳腺癌细胞BT549侵袭的影响Figure 7 Effect of miR-326 on invasion of breast cancer cells BT549

3 讨论

近年的研究结果表明,乳腺癌组织中存在许多微小RNA(miRNA)的异常表达,miRNA在乳腺癌发生发展中具有重要作用[6,7]。miR-326在近年来的miRNA研究领域备受关注[8],miR-326在乳腺癌中的研究未见报道。有研究表明[9],miR-326在胃癌组织和细胞株中的表达下降,miR-326的表达水平与胃癌临床分期、淋巴结转移相关,miR-326可负向调控调控胃癌细胞的生长、迁移和侵袭。另外,miR-326在非小细胞肺癌组织和细胞系中明显下调,miR-326通过靶向癌基因细胞周期蛋白D1,抑制细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞的凋亡[10]。不仅如此,miR-326可作为骨肉瘤的诊断性生物标志物,负向调节骨肉瘤细胞的生长和细胞凋亡[11]。miR-326也可抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡[12]。miR-326在肝细胞癌组织和细胞株中显著下调,低水平的miR-326与肝癌患者的TNM分期和淋巴结转移显著相关,miR-326可在体外抑制肝癌细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡[4]。同样,miR-326通过靶向转录因子ELK1抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。

本研究结果显示,乳腺癌细胞株中miR-326呈低表达,说明miR-326在乳腺癌中被抑制,可能与乳腺癌的发生发展有关。生物信息学方法预测miR-326的靶基因为CARD10。CARD10是一种癌基因,在多种肿瘤中呈现高表达[13]。CARD10异常表达可激活肿瘤相关信号通路,发挥促癌效应[14]。CARD10在乳腺癌中高表达,可显著促进乳腺癌细胞的增殖[15]。本研究结果表明,过表达miR-326的BT549细胞中CARD10表达降低,说明miR-326表达增加能下调CARD10表达。通过双荧光素酶报告基因系统实验进一步验证miR-326与CARD10之间的靶向结合,miR-326能显著抑制CARD10-WT载体的报告荧光的强度,对将预测的结合部位进行突变处理后,miR-326无法下调CARD10-MUT载体的报告荧光强度。双荧光素酶报告基因系统实验说明CARD10 mRNA突变后,miR-326无法再结合到CARD10基因的3′UTR端,进一步证明CARD10是miR-326的靶基因。上皮间充质转化(EMT)是肿瘤发生转移的重要机制,N-cadherin、Snail和Slug蛋白是间质表型,E-cadherin蛋白是上皮表型,这几种蛋白表达改变与EMT的发生密切相关[16,17]。本研究结果显示,CARD10的低表达引起EMT相关表型改变,N-cadherin、Snail和Slug蛋白的表达下调,E-cadherin蛋白表达上调,EMT过程被抑制,乳腺癌BT549细胞增殖和侵袭的显著下降。

综上所述,过表达miR-326通过靶向调控CARD10基因的表达,导致乳腺癌细胞增殖和侵袭能力显著降低。本研究主要集中在体外细胞实验,下一步研究的方向是miR-326在体内的抑癌作用研究。并进一步通过收集临床乳腺癌组织表达,检测miR-326的表达,研究其在诊疗及预后的生物标志物价值。