一种高灵敏度荧光定量微流控芯片用于细菌感染的早期检测

李亚楠,张 辉

(1汕头大学医学院附属肿瘤医院,汕头 515031;2山西医科大学医学影像学系;*通讯作者,E-mail:zhanghui-mr@163.com)

细菌感染严重危害人类健康,早期快速检测感染特异标志物对疾病预防、治疗和避免抗菌药滥用意义重大。降钙素原(procalcitonin,PCT)是20世纪90年代由Assicot等[1]发现的重要炎症因子之一,对细菌感染性疾病诊断具有极高的特异性和敏感性,尤其对败血症、脓毒症、全身严重细菌感染、细菌性与非细菌性感染的鉴别及预后有重要作用,还可用于其他病原微生物感染的辅助诊断和用药指导[2-7]。

临床常用的PCT检测方法中,酶联免疫吸附法(ELISA)可定量,但操作过程繁琐,耗时较长且人为误差大;放射性免疫分析法和放射免疫浊度法虽然可高灵敏度定量检测,但耗时较长,且放射性核素存在严重污染;化学发光法操作简单,敏感度高,特异性强,但配套的检测仪器成本昂贵,且化学发光剂易污染;胶体金法简便快捷,适合床旁即时检测,但无法定量,且样本在纤维素膜中的流动不可控,无样本管理功能。综合对比,微流控芯片技术因其耗样量少、效率高、成本低、易集成、好兼容等优势,是新一代即时检测(point-of-care testing,POCT)的主流技术[8],免疫荧光技术把抗原抗体和荧光色素结合使用,敏感性高、特异性强、反应快速,成为诊断学领域的重要手段之一,已用于多种疾病标志物的早期检测[9,10]。

基于以上背景,本研究的目的是首先开发基于免疫荧光技术的PCT定量检测微流控芯片,建立完善的微流控技术平台,技术成熟后,将来可拓展应用至其他重大疾病标志物的快速检测,具有极大的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 酶标仪(SUNRISE)、荧光显微镜(RX50RFL,宁波舜宇仪器有限公司)、动态光散射粒度分析仪(Nano-ZS ZEN3600 Malvern Instruments)、接触角测量仪(SDC-200，东莞市晟鼎精密仪器有限公司)、自动点样仪(AD3220，Bio-Dot公司)

1.1.2 试剂 PCT抗原及两种单克隆抗体PCT1#、PCT2#,羊抗鼠IgG抗体购自Abcam公司;羧基化荧光微球:Fluoresbrite®Carboxylate Microspheres 1.75 μm,Cat.# 17797-1,微球活化试剂盒:PolyLink Protein Coupling Kit,Cat.# 24350-1,购自美国Polyscience公司;3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液(CBS)、偶联物稳定剂、Tween 20、蔗糖、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、Proclin 300购自Sigma公司;BCA蛋白定量试剂盒、无水乙醇等其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司;超纯水:Millipore纯水仪制,电阻率为18.2 MΩ·cm(25 ℃)。

1.2 方法

1.2.1 芯片加工 该芯片由下板和上板两部分组成,根据流动和检测要求,在下板上设计加样区、导流区、微球区、时控区、流道、检测区、废液区,上板对应位置设置加样孔和排气孔,下板四周均匀设置键合线,芯片委托北京某模具公司使用聚苯乙烯(PS)注塑加工而成。

1.2.2 芯片表面改性 芯片固有的强疏水性导致液体在芯片内部无法流动,需进行表面改性。方法如下:芯片分别在无水乙醇和去离子水中超声清洗30 min,N2吹干;等离子体清洗机中活化500 s(参数为:O2气压10 Pa,功率150 W,放电500 s),随后放入2% APTES溶液中浸泡30 min,水清洗后80 ℃烘箱中30 min烘干。控制处理后芯片的水接触角在60°左右。

1.2.3 微球标记抗体 使用羧基化微球和配套的蛋白标记试剂盒,按照说明书方法将PCT1#抗体标记在微球表面,标记原理见图1所示。

图1 微球标记抗体原理图Figure 1 The schematic diagram of microsphere labeled with antibody

1.2.4 试剂固定 使用自动点样仪对微球区和C、T区进行点样。微球区、C区、T区的点样试剂分别为2.5 μl PCT1#抗体标记的微球溶液(固含量0.1%)、0.3 μl 1 mg/mL羊抗鼠IgG抗体、0.3 μl 1 mg/ml PCT2#抗体,点样完成后立即放入37 ℃恒温箱中干燥1 h。

1.2.5 键合成型 包被试剂的芯片下板加样区放入样品垫(光滑面朝上),上下板精确卡扣后超声键合成型,检测时液体在芯片中由毛细力驱动流动。

1.2.6 标志物检测 配制不同PCT浓度(0,0.02,0.5,2,10 ng/ml)的血清样本,包被芯片从冰箱取出恢复至室温,分别滴加200 μl血清样本,荧光显微镜下拍摄视频,观察流动性;荧光定量分析仪读取荧光值,Origin软件作图分析信号强度。

为了建立荧光强度和PCT浓度的关系,配制0,0.02,0.05,1,5,10 ng/ml的PCT血清样本,荧光定量分析仪读值,绘制T区曲线峰值和PCT浓度的对应关系,拟合标准曲线,用于实际样本中的PCT定量分析。

2 结果

2.1 芯片加工

2.1.1 芯片加工 根据设计要求,其中下板上加样区的设计依据是保证充分容纳200 μl的样本量,导流区是引导检测液体均匀进入微球区,待测抗原与微球区中的捕获抗体进行反应,时控区是为了控制流速,保证抗原抗体充分反应,检测区是通过包被的检测抗体识别微球区已经参加反应的抗原抗体复合物,以便显色荧光,指示抗原浓度,废液区是为了承载未反应的检测液,以及反应完冲洗流道的清洗液。用SolidWorks软件绘制图纸,并委托北京某模具公司根据图纸注塑模具、加工芯片,图纸设计、芯片模具及实物见图2。

2.1.2 表面修饰 先用O2等离子体处理疏水芯片表面(水接触角95°,见图3A),使其富含羟基,接触角变为15°,为了克服羟基化表面的不稳定性,用APTES硅烷化试剂处理芯片表面后,APTES中硅上的乙氧基通过水解作用与芯片表面的羟基连接,从而使芯片表面富含-NH2而具有更稳定的表面性质,接触角变为60°(见图3B)。

2.2 试剂包被

2.2.1 荧光微球标记抗体 紫外可见分光光度计测试微球的激发发射光谱,测得微球的激发波长为640 nm,发射波长为660 nm,与说明书参考值641/662 nm相符;荧光显微镜下用632 nm的激发光照射,可观察到红色微球,粒径约为1.75 μm(见图4),参照Polyscience微球标记试剂盒说明书把PCT1#抗体标记到微球表面,偶联体系的抗体效价为分子态的1/4;进一步用动态光散射仪分析偶联前微球直径为1.966 μm,偶联后为2.463 μm,偶联后仍能保持较强的红色荧光。

2.2.2 试剂包被与芯片成型 在芯片下板的微球区、C区、T区分别用Bio-Dot自动点样仪滴加实验部分所列试剂,恒温恒湿条件下包被1 h后取出,与上板紧密键合,铝箔袋中加入干燥剂,空气热封后4 ℃冷藏待用。

图2 芯片图纸、模具及实物图Figure 2 The drawing, mold and product of microfluidic chip

A.处理前 B.硅烷化处理后图3 芯片表面处理前后的接触角测量结果Figure 3 The contact angle of microfluidic chip before and after surface treatment

2.3 样本检测

2.3.1 样本流动 用恢复至室温的正常人血清配制不同浓度的PCT样本,根据临床检测参考值,选择的PCT浓度为10，2，0.5，0.02，0 ng/ml,各取200 μl加入芯片加样孔,荧光显微镜下观察血清流动和各区域荧光变化情况,测得总流动时间为(10±1)min,其中反应时间7 min(荧光微球与含PCT抗原的血清混合体系开始接触T区到所有荧光物质完全离开T区的时间),冲洗时间3 min(所有荧光物质离开T区到流动静止的时间)。

2.3.2 PCT检测 随机选取三块芯片,正常人血清流动前后分别在荧光显微镜下观察微球区形态,加入样本前,微球区呈现类梯形红色荧光,接触样本后,30 s内被充分溶解,残留较少(见图5)。不同浓度的PCT血清样本流动15 min后,荧光显微镜下观察C、T区形貌和荧光亮度,从图6可知,反应后,C区亮度均匀,质控一致,T区荧光强度随PCT浓度增大而增强,变化趋势与浓度梯度具有较好的一致性,肉眼可明显区分到市场已有产品的检测下限(0.02 ng/ml)和临床检测阈值(0.5 ng/ml)。进一步地,为了总结荧光强度和PCT浓度的关系,用荧光微球母液制备荧光强度梯度变化的标准芯片,用荧光定量分析仪读值,拟合标准曲线,如图7所示,与荧光显微镜下的肉眼观测结果一致,T区荧光强度值随PCT浓度增大而增强,呈现良好的线性关系,Y=27.65X+9.05,R2=0.995,X和Y分别代表PCT浓度和荧光强度,该公式将被编写入荧光定量分析仪内部,实际检测时根据实测荧光强度值直接导出PCT浓度,为临床诊断和指导用药提供依据。

A.荧光显微镜明场下观察荧光物质为直径1.75 μm的微球 B.632 nm激发光照射下可见微球发射明显的红色荧光图4 荧光微球的形貌、尺寸和荧光表征Figure 4 The morphology, size and fluorescence characterization of microspheres

A1、A2为芯片1;B1、B2为芯片2;C1、C2为芯片3;A1、B1、C1为血清流动前;A2、B2、C2为血清流动15 min后的芯片状态,白色框线标示的是三个芯片的微球区图5 正常人血清流动前后的微球区形貌及荧光变化情况Figure 5 Microsphere region morphology and fluorescence change before and after serum flow

3 讨论

根据微流控芯片POCT产品对检测过程的特殊要求[11,12],设计200 μl样本量、10-15 min反应读值时间、包含加样区、导流区、微球区、时控区、流道区、检测区、废液区的微流控芯片,选用低背景、无干扰、高纯度、高透光率的PS原料,成功注塑微流控芯片,可批量生产。

试验气体种类、气压、功率、时间对芯片等离子处理效果的影响情况,以及硅烷化试剂、溶剂、浓度、比例、处理时间、干燥方式、取放模式等因素对等离子芯片硅烷化修饰效果的影响,综合分析后得出最佳处理工艺为O2处理、气压10 Pa、功率150 W,放电时间500 s,2%的APTES水溶液中处理30 min,80 ℃烘箱中干燥30 min,每步仅支持佩戴无粉手套用塑料镊子取放。按照以上工艺,可稳定控制芯片接触角在60°左右,该接触角可增强蛋白固定效果及长期稳定性。

A1、B1、C1、D1、E1为血清流动前的芯片状态;A2、B2、C2、D2、E2为血清流动15 min后芯片中的荧光分布情况;A1、A2血清中的PCT浓度为10 ng/ml;B1、B2为2 ng/ml;C1、C2为0.5 ng/ml;D1、D2为0.02 ng/ml;E1、E2为0 ng/ml图6 荧光显微镜下观察不同PCT浓度血清样本流过芯片后对应的C、T区荧光强度Figure 6 Fluorescence intensity of C and T regions of microfluidic chips treated by serum samples with different PCT concentrations

A.标准芯片C、T区荧光强度与PCT浓度的对应关系(其中位移16 mm处为T区,32 mm处为C区) B.T区荧光强度值与PCT浓度的线性拟合关系图7 荧光强度与PCT浓度的对应关系Figure 7 The correlation between C, T regions fluorescence intensity of standard chips and PCT concentration

荧光微球的激发和发射波长分别为640/660 nm,632 nm激发光照射下可观察到粒径1.75 μm的红色微球,PCT1#抗体标记后微球抗体偶联体系的效价为分子态抗体的1/4,由于标记过程中需要三次清洗游离抗体,且微球有空间位阻效应,ELISA间接法测效价时影响抗体与包被抗原的结合从而导致效价降低;动态光散射仪分析偶联后微球有0.497 μm的标记蛋白层,且偶联前粒径比荧光显微镜观察结果大0.216 μm,这是由于溶液状态下测试的是被水化膜包裹后的微球尺寸,相比干燥状态下偏大。

包被完试剂并键合成型后,血清在芯片中的总流动时间为10 min,其中反应7 min,洗涤3 min,符合最佳的反应洗涤时间比,可保证较强的检测信号[13,14]。

微球区接触样本后,30 s内充分溶解,流动15 min后,C区质控均匀,T区荧光强度变化与浓度梯度具有明显的一致性,标准芯片的T区荧光强度与PCT浓度呈现良好的线性关系,Y=27.65X+9.05,R2=0.995。该微流控芯片可肉眼分辨目前已有PCT检测产品的检测下限(0.02 ng/ml)和PCT的临床阈值(0.5 ng/ml),拟合的曲线将内置于荧光定量分析仪,配合临床检测和指导治疗。

4 小结

本研究以定量检测PCT的免疫荧光微流控芯片为出发点,成功完成芯片选材、模具开发、注塑加工、表面改性、试剂包被、样本检测,达到临床要求,各项性能优于已有产品。成功搭建了微流控技术平台,目前正在收集临床样本,待进行大样本量的临床检测;进而完成恶性肿瘤、微生物感染、心脑血管、神经精神系统、激素类等其他重大疾病标志物的早期快速诊断,实现平台技术的拓展应用。

总之,免疫荧光微流控芯片用于微生物感染快速检验已成为POCT的重要发展方向,但仍需不断加大样本量、与其他先进技术结合,实现诸多重大疾病的早期快速联合检测,使技术体系更趋完善。