RhoA在胃癌中的异常表达及意义

姬文文,李 瑶,刘建兵,刘敏丽

(延安大学医学院病理教研室,延安 716000;*通讯作者,E-mail:782071285@qq.com)

胃癌是全球高发病率、高致死率的常见恶性肿瘤,由于其早期症状不明显、淋巴转移早、复发率高且患者预后较差,导致胃癌的病死率居高不下。肿瘤的浸润转移是影响预后的重要因素。RhoA是具有GTP酶活性的小分子G蛋白,类似“分子开关”,能通过调控下游的效应分子,改变肌动蛋白的结构,调节细胞的生物学行为,包括细胞形态、极性、增殖、凋亡、黏附及迁移[1]。RhoA与肿瘤细胞的生长繁殖、肿瘤血管生成及浸润转移等进程关系密切。本研究通过检测RhoA在胃癌中的表达情况,分析其与胃癌患者临床病理因素的关系,来探讨其在胃癌发生发展过程中的生物学意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 组织标本来源与处理 收集延安市人民医院2016-08～2017-12就诊的经病理检查确诊的、未经放化疗的手术切除标本63例和胃镜标本39例,其中包括胃癌组织78例及癌旁胃黏膜组织24例(距癌组织边缘>5 cm,经HE染色证实没有癌细胞)。新鲜切除的小部分手术标本离体后立即置于液氮中,后置于-70 ℃冰箱保存,其余手术标本和胃镜标本用10%的福尔马林液固定。整理记录临床数据及病理学数据,包括每个病例的年龄、性别、分化程度、浸润深度,并检查有无淋巴结转移。同时选取18例正常胃黏膜组织胃镜标本作为对照组。在收集标本之前均得到了患者的同意,并获得了医院伦理委员会的批准。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人RhoA单克隆浓缩型抗体(Biorbyt,英国)、酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、内源性过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、柠檬酸组织抗原修复缓冲液、DAB显色试剂盒,均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 免疫组化检测

所有标本均采用10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋,4 μm厚连续切片,然后采用免疫组化SupervisionTM二步法检测。RhoA抗体以1 ∶200比例稀释,用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波修复。已知的阳性切片作为阳性对照,用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定方法

RhoA阳性表达定位于细胞膜和细胞浆。实验过程中,采用双盲法,随机进行编号,操作过程及阅片过程中均不知道病理和临床资料。每张切片选5个不同高倍镜视野,每个视野计数100个癌细胞,观察肿瘤细胞免疫组化染色的情况,评分方法如下:①细胞染色强弱分级,无着色为0分,浅褐色为1分,棕黄或褐色为2分,深褐色为3分。②阳性细胞数分级,1%-25%为1分,25%-50%为2分,50%-75%为3分,75%-100%为4分。③二者乘积为评分结果:0为(-),1-4分为(+),5-8分为(++),9-12分为(+++)。统计分析时记(-)为阴性,(+)-(+++)为阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS16.0统计分析软件进行数据处理,利用χ2检验分析RhoA与胃癌临床特征之间的关系,P<0.05说明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中RhoA蛋白的表达情况

RhoA阳性染色主要位于胞质和胞膜,呈棕褐色(见图1)。胃癌组织中RhoA的阳性表达率为59.0%,癌旁组织和正常胃黏膜组织中RhoA的阳性表达率分别为25.0%和22.2%。RhoA蛋白在胃癌组织中的表达比癌旁组织或正常胃黏膜组织的表达高,且差异具有统计学意义。而癌旁组织与正常胃黏膜组织的RhoA蛋白表达比较,差异无统计学意义(见表1)。

2.2 RhoA蛋白表达水平与胃癌临床病理特征关系

RhoA表达水平与肿瘤浸润深度、是否伴有淋巴结转移和肿瘤的分化程度均有关(P<0.05),但与性别、年龄无关(P>0.05,见表2)。

A.胞膜、胞质着色,RhoA阳性 (×100) B.胞膜、胞质着色,RhoA阳性 (×400)图1 免疫组化法检测RhoA在胃癌组织中的表达Figure 1 Expression of RhoA protein in gastric carcinoma detected by immunohistochemistry

表1不同组织中RhoA的表达(例)

Table1ExpressionofRhoAindifferenttissues(cases)

组别nRhoA-++++++阳性率(%)胃癌组织78322217759.0*癌旁组织241851025.0正常胃黏膜组织181431022.2

与正常或癌旁组织比较,*P<0.05

表2胃癌组织中RhoA蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

Table2ExpressionofRhoAproteiningastriccarcinomaanditscorrelationwithclinicopathologicalfeaturesofgastriccarcinoma

病例参数nRhoA表达(例)-++++++阳性率(%)χ2P性别0.8240.844 男4720139557.4 女311298261.3年龄5.5850.134 <50岁237114169.6 ≥50岁55251113654.5浸润深度14.1630.028 黏膜层12821133.3 肌层241381245.8 浆膜层42111215473.8淋巴结转移16.5560.001 有45111316575.6 无332191236.4分化程度30.7790.000 高中分化382872126.3 低分化4041515690.0

3 讨论

胃癌的病死率居于恶性肿瘤前列,且预后较差。目前胃癌的Laurén分类在临床实践中应用最广泛,因为它反映了胃癌形态学、肿瘤生物学、流行病学、临床管理和预后。虽然有个体化抗肿瘤治疗的最初承诺,但并没有实现。而胃癌的分子分类及其治疗意义被广泛研究,为新的分子靶向治疗提供更多的可能性[2]。因此,寻找能反映肿瘤侵袭转移的客观指标,并将其尽早地应用到临床,来实现个体化抗肿瘤治疗的目的。

RhoA全称Ras同源类似物A(Ras homology A),是具有GTP酶活性的小分子G蛋白,在细胞中起细胞表面受体及不同细胞内信号蛋白的调节器的作用。RhoA的激活为不断处于结合GDP的失活态和结合GTP的活化态的循环,受3种调控因子即鸟苷酸交换因子(GEF)、GTP酶活化蛋白(GAP)和GDP解离抑制剂(GDI)维持其功能状态[3]。GDP在GEF的催化作用下转换为GTP;相反,GAP催化水解GTP的磷酸基团位点,GTP转换为GDP,失去活性,阻止RhoA与效应分子的相互作用。GDI的作用是使RhoA发生沉默或抑制G蛋白的激活[4]。与RhoA直接相互作用的效应分子有ROCK1/2、mDia、PRK1/2citron激酶、rhoteckin、rhophillin等,活化状态下的RhoA转位到细胞膜,与这些效应分子结合,继而开启下游的信号通路。起到改变细胞的骨架结构,参与肿瘤细胞的黏附、收缩、移动、黏附解除、基质的降解,及对血管和淋巴脉管系统侵入的调控等作用,在肿瘤的研究中认为其参与了增强肿瘤侵袭和转移过程。当肿瘤开始启动生长时,活化的RhoA高度表达,并有效地调控了高度未分化的细胞进行克隆性增生,参与到肿瘤发生发展的各个环节。RhoA与癌基因密切相关。其一,研究发现多种癌基因所导致的细胞恶性转化过程必须有Rho家族参与。干扰RhoA表达后,有大量的caspase家族分子和凋亡诱导因子被激活,抑癌基因表达上调,与TNF相关的因子也有显著上调,导致凋亡趋势明显增强。其二,Rho GTP酶本身也会恶性转化。RhoA基因突变在丢失与GTP结合的能力的同时,获得了癌基因的活性[5]。

本研究结果显示,RhoA在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织和正常胃黏膜组织(P<0.05)。RhoA阳性表达率与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及分化程度等密切联系。分化程度低的胃癌组织中的RhoA阳性表达率明显高于中、高分化胃癌组织;RhoA在有淋巴结转移的胃癌组织中的表达显著高于无淋巴结转移的胃癌组织,提示RhoA蛋白的表达与胃癌淋巴结转移有密切关系;侵及浆膜层的胃癌组织中RhoA阳性表达率明显高于侵犯黏膜层及肌层的胃癌组织。均提示RhoA蛋白不仅在胃癌组织中表达增高,而且其表达水平与胃癌的浸润和转移,即恶性程度相关。

有研究[6]发现,miR-31水平在胃癌中明显下调,而用miR-31可抑制胃癌的裸鼠异种移植模型中胃癌转移。用脂质体介导RhoA转染胃癌MGC-803细胞,结果RhoA基因沉默后细胞周期被阻断在G0/G1期,表明特异性干扰RhoA基因表达可以抑制胃癌MGC-803细胞的迁移能力,并抑制肿瘤细胞增殖。Yoon等[7]研究指出,抑制RhoA信号通路可克服弥漫型胃癌干细胞对氟尿嘧啶和顺铂的化疗耐受。均提示RhoA有望成为胃癌基因治疗的一个重要分子靶点。肿瘤RhoA高表达为弥漫型胃癌的独立预后因素,提示RhoA信号对弥漫型胃癌患者的生存有重要影响[8]。

所以,检测胃癌组织中RhoA的表达,对胃癌的诊断、防治及预后提供新的思路,从而有助于减少胃癌的转移恶化和复发,降低我国胃癌的病死率。