砷对大鼠附睾中肝细胞生长因子及其受体c-met表达与透明质酸酶活性的影响❋

戴研平 高晓勤

(1 贵州医科大学基础医学院, 贵阳 550004; 2 遵义医药高等专科学校, 遵义 563006; 3 岳阳市岳阳楼区人民医院, 岳阳 414000)

砷是一种广泛存在于自然界的环境毒物和人类致癌物[1]。我国是深受地方性砷中毒危害的国家之一。研究表明,长期慢性砷暴露可影响人类的生殖和发育[2]。附睾微环境对精子成熟起着重要作用[3]。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种多效性的因子,通过与受体c-Met结合后发挥多种生物学效应,能够促进细胞的分裂、迁移和血管的生成[4]。透明质酸酶是一种以降解透明质酸(hyaluronidase, HYD)为主的糖苷酶。目前关于HYD及其相关研究越来越引起人们的重视[5]。研究表明精液中HYD活性降低可能是引起男性不育的病因之一[6]。关于砷中毒与HGF及HYD相关研究少见报道。本研究通过探讨慢性砷中毒对大鼠HGF、c-met、精子HYD及其超微结构的影响,阐明砷造成精子HYD及精子功能改变的机制,为慢性砷中毒导致男性不育的防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择健康清洁级雄性SD大鼠40只,体质量160～200g,由贵州医科大学实验动物中心提供,许可证号： SCK(黔)2002-0001。动物饲养环境温度22℃～25℃,相对湿度为63%～65%。实验期间,大鼠可自由摄食、饮水。适应性饲养1周后,将大鼠随机分为4组,分别为对照组(蒸馏水)，低(2.4mg/L)、中(12.0mg/L)、高(60．0mg/L) 剂量砷染毒组,每组10只。采用自由饮用方式连续染毒6月。

1.2 标本处理

染毒结束后处死动物,无菌条件下摘取双侧附睾组织,仔细去除周围脂肪组织及筋膜,生理盐水快速冲洗。立即分离右侧附睾尾部,放置预热37℃磷酸盐缓冲液(PBS)中剪碎,待精子游出,一部分用于HYD活性的检测,另一部分用于电镜下观察。

1.3 主要试剂

亚砷酸钠(As2O3,分析纯,中国北京化工厂);1%锇酸、3%戊二醛、醋酸铀(中国北京化工厂);Epon 812环氧树脂(沈阳市强华试剂厂);透明质酸钠(山东福瑞达生物化工有限公司);明胶(成都化学试剂厂);36%醋酸、醋酸钠(成都市联合化工试剂研究所);40%甲醛(重庆茂业化学试剂有限公司)；HGF、c-met兔抗鼠多克隆抗体(英国Abcam公司)。

1.4 免疫印迹检测附睾组织内HGF、c-met蛋白表达水平

每组随机选取6只大鼠左侧的附睾,按1∶5(m/V)加入裂解液,组织匀浆,冰上裂解1h,于4℃、12000r/min离心(离心半径为4cm)15min,取上清,即为蛋白样品,-80℃备用。采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白用1×蛋白上样缓冲液稀释后,沸水煮5min,每孔上样20μl,经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,取相应条带经5%脱脂奶粉室温封闭2h后,加入β-actin抗体(1∶1000稀释)和HGF、c-met兔抗鼠多克隆抗体(1∶500稀释),4℃ 孵育过夜,TBST 缓冲液洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5000稀释),室温振荡孵育1.5h,TBST洗膜后,采用化学发光法进行检测,凝胶成像系统成像,采用Image-J软件进行灰度值分析。蛋白表达结果以目的蛋白灰度值与内参蛋白(β-actin)灰度值的比值表示。

1．5 HYD活性的检测方法

处死大鼠,立即分离右侧附睾尾部,放入预热37℃磷酸盐缓冲液(PBS)中剪碎,待精子游出,吸取上清液,室温下以2000r/min(离心半径16cm)离心2次,每次10min,并用PBS液清洗,将沉淀物悬浮于2倍以上PBS液中,放入37℃恒温恒湿箱内。利用HYD、双蒸水、12%明胶溶液等制备HYD一明胶底膜片,40%甲醛中固定1h后,置于0．2mmol/L醋酸一醋酸钠缓冲液(pH4．2)中20min,以校正pH值。取备用的PBS精子悬浮液1～2滴涂于底物膜片上,放入37℃恒温恒湿箱中孵育3h,检测HYD阳性率及活性强度。

1.6 扫描电镜(SEM)样品制备及观察

分别取各组部分附睾尾部精子经PBS液洗涤,以3000r/min 离心(离心半径为4cm)10min×3次;PBS液漂洗15min×3次;将沉淀物悬浮于3%戊二醛中固定24h;1%锇酸再固定0.5h,PBS液洗涤,离心,乙醇梯度脱水,100%的醋酸异戌酯置换乙醇10min×3次,涂片,干燥,喷金,用S-3400N扫描电镜观察。每个标本观察200个完整精子,并计算精子顶体完整率(顶体完整率=顶体完整的精子数/精子总数×100%)和精子畸形率(精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%)。

1．7 观察指标

1.7.1 HYD的反应阳性率 终止孵育后,每份精子孵育片于光学显微镜下均匀选取5、6个视野观察200个精子的头部,其周围出现晕环者视为HYD阳性反应,计算精子HYD阳性率。

1.7.2 HYD的活性强度 采用微尺测量每个精子头部晕环直径的大小,计算平均反应直径(μm),作为判断HYD活性强度的指标。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 免疫印迹检测正常组和砷染毒组大鼠HGF、c-met蛋白的表达

与对照组比较,各浓度砷染毒组大鼠附睾组织内HGF、c-met蛋白表达水平均较低,差异有统计学意义(P<0.05);且随着砷染毒浓度的升高,大鼠附睾组织内HGF、c-met的蛋白的表达水平呈下降趋势(图1，表1)。

2.2 砷染毒前、后精子HYD活性的比较

光镜下,对照组精子头部出现明显的晕环,直径较大,数量较多。各染毒组随着染砷剂量的增加,晕环的直径变小,数量减少(图2)。对照组孵育12h后(图2A),阳性率可达90.1%,平均反应区直径为44.2μm2;低剂量组孵育12h后(图2B),阳性率可达80.3%,平均反应区直径为29.1μm2;中剂量组孵育12h后(图2C),阳性率可达58.0%,平均反应区直径为18.9μm2;高剂量组孵育12h后阳性率可达21.6%(图2D),平均反应区直径为9.5μm2。与对照组相比,低剂量组HYD阳性率、活性强度无明显差异(P>0.05),而中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。随着染砷剂量的升高,精子HYD阳性率和活性强度呈逐渐下降趋势。

图1 慢性砷染毒大鼠附睾组织内HGF、c-met蛋白的表达

GroupHGF/β-actinc-met/β-actinControl group0.50±0.170.47±0.13Low dose group0.32±0.12*0.29±0.10*Middle dose group0.15±0.10*0.17±0.09*High dose group0.07±0.01*0.09±0.03*

*P<0. 05vscontrol

2.3 精子扫描电镜结果

在扫描电镜下(图3),对照组精子形态正常,头部呈镰刀状,顶体结构完整,后环无缺如,边界清晰,边缘整齐,可见清晰的赤道板,表面无空洞结构,颈部与头部衔接紧密、无断裂、精子膜完好,顶体结构正常。砷中毒各剂量组精子的头部出现不同程度的变形,顶体结构不完整,出现肿胀破裂、颗粒黏附、头部包膜皱缩、尾部质膜明显受损,甚至脱落。颈部与头部衔接不紧密,染毒剂量越高,精子形态改变越明显。慢性砷染毒大鼠精子顶体完整率、精子畸形率的变化见表2。

与对照组比较,低、中、高砷染毒组大鼠精子顶体完整率均较低,而精子畸形率均较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 正常组(A)和低、中、高砷染毒组(B、C、D)的HYD阳性反应及HYD活性观察，×400

3 讨论

据世界卫生组织统计,全球约有8000万对夫妇罹临不育,其中40%为男性不育,其主要因素是精子功能不全[7]。顶体位于精子的头部,顶体反应发生时,引起顶体内十多种顶体内酶释放,作用于卵子透明带,协助精子进入卵细胞,从而完成受精[8]。其中精子顶体内的HYD与受精关系密切,在受精过程中的精卵识别、结合阶段起至关重要的作用[9-10]。测定精子HYD活性是评价精子功能的指标之一。本研究采用的改良HYD-明胶底物膜法不仅能检测慢性砷染毒大鼠精子顶体内HYD活性,还能估计单个精子HYD活性的强弱。

图3 慢性砷染毒大鼠精子扫描电镜图，×10000

GroupAcrosome intact rateSperm malformation rateControl group92.80±6.2021.73±5.75Low dose group87.25±3.56*26.60±8.20*Middle dose group75.60±6.09*35.75±6.42*High dose group63.30±6.13*43.80±7.06*

*P<0.05vscontrol group

众所周知,慢性砷中毒能够引起导致男性不育。砷染毒后精子超微结构的改变主要在顶体。本研究改良透明膜底物法显示,与对照组相比,砷染毒低剂量组HYD阳性率、活性强度无明显差异,而中、高剂量组显著下降。由于HYD活性降低,会导致精子溶解卵丘细胞外基质的能力减弱,不利于精子穿过卵丘,引起精子与卵细胞结合能力减弱,阻碍受精,影响生育能力,最终会导致体外受精的成功率也不高。

HGF是一种多效生长因子,它的生物学活性是由原癌基因c-met编码的受体蛋白介导实现的,HGF与c-met受体结合后可引起一系列化学反应,最终激活多条信号转导通路[11]。研究表明,HGF具有修复组织损伤、促进细胞分化、促血管生成的作用,通过抑制caspase-3的表达或诱导抗凋亡分子的产生,从而发挥抗凋亡的作用[12]。c-met广泛表达于人类和啮齿类动物的生精细胞[13]。HGF-c-met信号通路通过影响内分泌信号参与生精细胞凋亡的调控[14-15]。

研究表明精子结构异常严重影响正常受孕,甚至可导致男性不育[16]。附睾是精子成熟、储存和获能的场所,该部分细胞易受外界各种有害物质影响[17]。本研究免疫印迹检测结果显示砷染毒各组大鼠附睾HGF、c-met蛋白表达水平均显著下降,说明砷可能通过抑制HGF及其受体c-met的蛋白表达水平,从而干扰HGF/c-met信号通路,引起大鼠附睾及精子HYD或功能的异常。

顶体是精子头部的重要组成部分,顶体结构发生异常最终会导致男性的生育能力下降[18]。精子质膜在精子信息传递、顶体反应和精卵结合中发挥重要作用[19]。本研究结果显示,与对照组比较,砷染毒各剂量组大鼠精子顶体完整率下降,而精子畸形率升高,差异均有统计学意义。说明砷染毒可使顶体内HYD流失减少,导致精子获能和顶体反应异常,从而影响精子受精,这也为本实验改良底物膜法检测慢性砷中毒使得精子HYD活性下降的结果提供了依据。

总之,本研究表明,慢性砷染毒大鼠HGF及c-met受体蛋白的表达减少并伴随精子HYD 活性下降,顶体完整率下降和精子畸形率升高,原因可能是砷作为一种环境内分泌干扰物[20],能够影响附睾微环境形成,通过影响HGF及其受体c-met的蛋白表达和顶体内HYD的活性,进而影响精子的结构和功能。这些均可能通过影响精卵识别位点,使精子与透明带结合能力下降,进而导致男性不育,但其具体机制有待进一步研究。