尼美舒利对胆管癌细胞Th1/Th2细胞因子分泌的影响

孔 琦，黄 强，陈 斌，王道明，朱家胜，夏亚斌

(1.皖南医学院弋矶山医院胃肠外科，安徽 芜湖 241001;2.安徽省立医院普外科，安徽 合肥 230001)

正常机体免疫功能需Th1、Th2细胞因子维持一定的动态平衡，当平衡失调造成Th1或Th2转化时，称之为Th1/Th2偏移[1]，而Th1/Th2偏移与肿瘤的发生、发展密切相关[2-3]，进一步研究Th1/Th2偏移如何影响恶性肿瘤的发生、发展成为目前研究重点，我们用白介素-2(interleukin-2，IL-2)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)作为Th1细胞因子代表，Th2细胞因子用IL-4、IL-6代表，观察尼美舒利对人胆管癌细胞Th1/Th2偏移的逆转作用，进一步探讨其对胆管癌细胞生长的影响，为选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂抗肿瘤作用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂人肝内胆管癌细胞系HCCC-9810购白中国科学院上海生命科学研究院细胞库；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent adsorption ，ELISA)试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗IFN-γ和荧光素(phycoerythrin，PE)标记的抗IL-4单抗均购自美国Biolegend公司。尼美舒利相对分子质量为308.3，购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1 细胞培养及药物准备 于RPMI-1640培养基中接种人肝内胆管癌细胞系HCCC-9810，饱和湿度培养箱内常规传代培养，每2～3 d进行传代1次。收集对数生长期细胞进行实验。取308.3 mg尼美舒利溶于1 mL的二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中，加入9 mL的培养基配成100 mmol·L-1母液，实验时用RPMI-1640培养基进行稀释，将其配成终浓度分别为25、50、100、200 μmol·L-1的尼美舒利备用。采用质量分数0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的胆管癌细胞,制成细胞密度为1×106·mL-1的单细胞悬液，以每孔2 mL接种于6孔板内，于恒温培养箱中培养细胞24 h，设立实验组与对照组进行实验，实验组加入不同浓度的尼美舒利，对照组不加药，检测相关指标。

1.2.2 细胞因子测定 收集对数生长期的胆管癌细胞，2 mL每孔接种于6孔板内，恒温培养箱中培养细胞24 h，设立实验组与对照组，实验组中加入不同浓度的尼美舒利继续培养，对照组不加药，每组设3个复孔，72 h后分别吸取上清液，用ELISA法分别检测IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ表达水平。

1.2.3 Th1、Th2亚群流式细胞仪检测 收集不同浓度尼美舒利处理48 h的胆管癌细胞HCCC-9810，离心后弃上清；细胞用磷酸盐缓冲液洗漂洗，加入固定液0.5 mL固定20 min，1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，加入2 mL穿透液，室温暗处10 min，1 000 r·min-1离心5 min，加入FITC标记的抗IFN-γ和PE标记的抗IL-4单抗，避光孵育30 min，2 mL穿透液漂洗1次，0.5 mL多聚甲醛悬浮细胞后应用流式细胞仪检测IFN-γ和IL-4水平。

2 结果

2.1尼美舒利对胆管癌细胞HCCC-9810中Th1、Th2细胞因子分泌的影响尼美舒利作用后，随其药物浓度升高，胆管癌细胞HCCC-9810中IL-2、IFN-γ水平升高，而IL-4、IL-6水平下降 (P<0.05)。见表1。

表1 尼美舒利对胆管癌细胞HCCC-9810中Th1、Th2细胞因子分泌的影响 ng·L-1

注：与尼美舒利0 μmol·L-1组比较，1)P<0.05

2.2尼美舒利对胆管癌细胞HCCC-9810中Th1/Th2比值的影响流式细胞仪显示随尼美舒利浓度升高，实验组Th1细胞阳性率升高，而Th2细胞呈下降趋势，Th1/Th2比值升高(P<0.05)。见表2。

表2 尼美舒利对胆管癌细胞HCCC-9810中Th1/Th2比值的影响

注：与尼美舒利0 μmol·L-1组比较，1)P<0.05

3 讨论

肿瘤的发生、发展与荷瘤机体的免疫状态密切相关，对多种肿瘤的研究发现，肿瘤组织能够通过分泌Th2细胞因子，改变Th1/Th2平衡以逃避免疫监视，Th2细胞优势状态是肿瘤细胞存活、发展的可能机制之一。Yamamura等[4]首先报道肿瘤患者呈Th2细胞因子优势表达，处于Th1/Th2偏移状态，这种偏移可能是导致肿瘤细胞产生免疫逃逸持续增长的机制。Li等[5]采用ELISA法检测了124例非小细胞肺癌患者和124例健康体检个体外周血术前术后Th1和Th2细胞因子的表达，结果发现非小细胞肺癌患者术前IL-4和IL-10水平明显升高，而IL-2和IFN-γ水平显著降低。同术前比较，术后患者IL-4和IL-10水平显著降低，而IL-2和IFN-γ水平明显升高。术后IL-4水平异常的患者1、3 a累积复发率明显高于正常患者，且中位生存时间和生存率显著降低。因此进一步研究肿瘤细胞Thl/Th2状态可能为肿瘤免疫治疗提供新的靶点。流行病学研究发现，长期口服非甾体抗炎药人群罹患肿瘤的发生减少，体内外实验也显示非甾体抗炎药能够通过抑制COX-2表达抑制多种肿瘤细胞的生长增殖。也有研究[6]发现COX-2通过催化花生四烯酸使其代谢产物前列腺素E2增加，进一步通过其受体抑制树突状细胞的分化和功能,通过Th1/Th2偏移减弱细胞免疫所调节的抗肿瘤反应，这为胆管癌的防治提供了新的分子靶点。我们前期试验[7-8]也发现，选择性COX-2抑制剂尼美舒利抑制胆管癌细胞的增殖，且呈明显的剂量与时间依赖性，作用机制可能与诱导胆管癌细胞凋亡有关。为进一步探讨COX-2抑制剂抑制肿瘤生长的作用机制，本研究继续采用选择性COX-2抑制剂尼美舒利作用于胆管癌细胞，观察其对胆管癌细胞Th1/Th2平衡的影响。我们采用ELISA法和流式细胞仪检测不同浓度尼美舒利作用于胆管癌细胞后Th1、Th2细胞因子的表达，以进一步探讨逆转Th1/Th2状态对肿瘤细胞的影响。我们发现，随药物浓度增加，IL-2、IFN-γ水平呈现上升趋势，而IL-4、IL-6水平下降，Th1/Th2比例升高，这种作用在低水平时就开始出现，并随着药物浓度升高而增强，表现为明显的逆转作用，这提示我们尼美舒利可能是通过诱导胆管癌细胞表达Th1细胞因子而抑制Th2细胞因子的表达，从而逆转Th1/Th2偏移，抑制肿瘤生长。

综上所述，胆管癌细胞Th2优势表达可能是肿瘤细胞逃避细胞免疫应答的机制之一，通过调节Th1/Th2平衡，改善机体免疫状态，从而实现对肿瘤的免疫治疗成为可能。