30个Y-STR基因座在中国汉族人群中的多态性与突变

吴微微 ，苏艳佳 ，梅兴林，吕德坚，周 翔，郝宏蕾，任文彦，刘 冰

（1.浙江省公安物证鉴定中心 浙江省刑事科学技术应用研究重点实验室，浙江 杭州 310009；2.浙江安宁生物科技有限公司，浙江 嘉兴 314000；3.中山大学中山医学院法医学系，广东 广州 510089；4.公安部物证鉴定中心，北京 100038）

Y 染色体 STR（Y chromosome short tandem repat，Y-STR）在减数分裂过程中不发生重组，为男性所特有，以单倍型形式呈父系遗传的特点。与常染色体STR基因座相比，Y-STR基因座具有显著的人群、地域分布特征。因此，Y-STR基因座被广泛应用于法医学个体识别、亲权鉴定、混合斑中男性成分的检测以及族群的起源和迁徙等多个领域[1-2]。2004年，美国ABI公司推出了Yfiler试剂盒，可以同步扩增检测17个Y-STR基因座。然而随着中国Y-STR数据库的建设，出现了如嫌疑人Y-STR分型与多个不同家系17个Y-STR分型匹配，造成嫌疑目标过多、排查困难的情况[3]。目前，主流的商业化Y-STR试剂盒基因座数量为21～27个，多个试剂盒引入了3～7个快速突变基因座。快速突变Y-STR基因座的突变率在1×10-2以上，一定程度上提高了Y-STR基因座区别近亲个体的能力，但是不利于刑事侦查中父系亲缘关系的搜索[4-6]。本研究采用通过六色荧光标记复合扩增技术自行研发的由30个中低突变率、具有中高识别能力的Y-STR基因座组成的复合扩增体系[7]，对中国汉族人群1005名男性无关个体和1008对支持亲子关系的父子进行分型，调查该30个Y-STR基因座在中国汉族男性人群中的等位基因频率、基因多态性、单倍型及其突变情况，为群体遗传学和Y-STR数据库建设等提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本

用经典型血样采集卡（长春博坤生物科技有限公司）采集中国汉族人群1 005名男性无关个体和1008对父子（1949份血样，其中1父1子的877例，1父2子的61例，1父3子的3例）的血液样本，案例均为本实验室日常检案与建库积累。所有父子关系样本均经常染色体STR检验支持亲子关系。

1.2 主要仪器与试剂

Freedom EVO®150-8全自动化液体处理工作站（瑞士Tecan公司），9700型PCR仪、3500xL基因分析仪（美国AB公司），1.2mm打孔器（美国Harris公司）。

数据库专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤生物科技有限公司），去离子甲酰胺（美国Thermo Fisher Scientific公司），C-Taq DNA聚合酶、内标SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司），男性DNA标准品9948（美国Promega公司）。

1.3 DNA提取

本研究中，有350份样本在全自动化工作站上采用磁珠法提取DNA，其余样本采用血卡直接扩增的方法。

1.4 PCR扩增

使用9700型PCR仪进行扩增，扩增体系为10μL，包含4μL反应混合物、2U C-Taq DNA聚合酶、2μL引物混合物以及0.5～2 ng DNA提取样本或1.2 mm血卡，剩余体积用去离子水补足。热循环参数：95℃2min；94℃ 15s，60℃ 1min，69℃ 1min，30 个循环；60℃ 15min；4℃保温。

1.5 电泳及分型

取1μL PCR 产物、9.5 μL 去离子甲酰胺和0.5μL内标SIZ-500，混匀，95℃保温3min并立即冰浴3min。使用3500xL基因分析仪以1.2kV、28s的进样模式进行电泳。电泳数据通过GeneMapperTMIDX v1.4软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行等位基因分型。

1.6 统计学处理

采用直接计数法计算1 005名男性无关个体各基因座等位基因与单倍型检出频率，基因多样性（GD）和单倍型多样性（HD）的计算公式为：

式（1）中，n为样本数，Pi为等位基因频率或单倍型频率；

单倍型识别能力（DC）的计算公式为：

式（2）中，H为单倍型种数，N为样本数。

分析1008对父子关系样本Y-STR基因座分型，统计等位基因传递次数与突变次数，其中多拷贝基因座的等位基因传递次数统计为相应拷贝数。根据网站（http://statpages.org/confint.html）的方法计算突变率以及 95%置信区间（confidence interval，CI）。

2 结 果

2.1 遗传多态性

1005名汉族男性无关个体30个Y-STR基因座共检出983种单倍型，其中963种为单一分型，18种检出两次，2种检出3次。总体HD值为0.999955，DC值为0.978109。

30个Y-STR基因座共检出340个等位基因，各基因座中GD值最高为DYS385a/b（0.952 3），最低为DYS391（0.4103）。除了 DYS389Ⅰ、DYS438、DYS391、DYS437、GATA_H4和DYS549基因座外，其余基因座的GD值均大于0.6，各基因座等位基因频率分布情况及GD值见表1～2。

表1 30个Y-STR基因座在中国汉族男性人群中的等位基因频率分布 （n=1005）

续表1

表2 30个Y-STR基因座在中国汉族男性人群中的GD值 （n=1005）

2.2 等位基因突变

1008对父子样本30个Y-STR基因座分型中共检测到30269次等位基因的遗传传递，其中在26个基因座上共发现74次突变，平均突变率为2.4×10-3，95%CI为（1.9×10-3，3.1×10-3）。其中突变率最高是DYS557，为 5.0×10-3，95%CI为（1.6×10-3，11.6×10-3），突变率最低的是 DYS392、DYS438、DYS587、DYS460、DYS643、DYS635 和 DYS443，为 1.0×10-3，95%CI为（0，5.5×10-3）。 而 DYS19、DYS437、DYS448 和 DYS520 4个基因座未发现突变。各基因座的突变情况见表3。

突变共涉及71对父子，其中68对突变仅在1个基因座上，3对突变同时发生在2个基因座上。在检出的74次突变中，一步突变73次（98.6%），两步突变1次（1.4%），为GATA_H4中14突变为12。突变时等位基因增加重复单位数50次（67.6%），减少重复单位数24次（32.4%）。发生两步突变和2个基因座同时突变的父子关系样本，结合相应母亲样本，经41个常染色体STR检验均确认为父子关系。

表3 30个Y-STR基因座在中国汉族男性人群中的突变情况

3 讨 论

DNA技术在法庭科学中可以起到排查或个体识别的作用。相对于常染色体STR基因座，Y-STR基因座单倍型在个体识别方面的识别力较低，不能作为唯一性个体识别的手段，只能起到辅助作用[8]。但是YSTR基因座呈父系遗传，同一父系个体具有相同分型的特点使得其适用于推断父系个体嫌疑人，通过搜索Y-STR数据库可以排查同一父系的犯罪嫌疑人。目前商品化Y-STR试剂盒主要有Yfiler、Yfiler Plus和PowerPlex Y23等，包含基因座数量分别为17、27和23个，其中Yfiler Plus、PowerPlex Y23试剂盒包含了3～7个快速突变基因座，这些快速突变的Y-STR基因座有利于将近亲个体如父子或兄弟区别开来[9]，但容易使同一父系个体出现不同的单倍型。所以，快速突变基因座在父系亲缘关系鉴定中容易造成有亲缘关系男性个体的错误排除，不利于通过家系搜索来侦查破案。本研究30个Y-STR基因座中，突变率最高为 5.0×10-3（DYS557），不含有快速突变基因座，平均突变率为 2.4×10-3，95%CI为（1.9×10-3，3.1×10-3），在既往报道[5]的46个Y-STR基因座的突变率范围［平均为 4.1×10-3，95%CI为（3.6×10-3，4.7×10-3）］之外，总体上更具有遗传稳定性，更少发生突变干扰父系关系判断的情况。

本研究30个Y-STR基因座检测体系的HD值为0.999955，DC值为0.978109，高于Yfiler试剂盒的17个Y-STR基因座（HD值和DC值分别为0.999268和0.90908）[2]，更有利于将随机个体区分开来；但小于46个Y-STR基因座（HD值和DC值分别为0.99998和0.998 3）[5]，其原因除了基因座数目少以外，也与46个Y-STR基因座中含有中、快速突变基因座有关，因为Y-STR基因座在减数分裂中不重组，多态性的形成主要通过突变，快速突变的基因座往往具有较高的多态性。

较高的HD和DC意味着更容易将随机个体区分开来，但是由于STR突变，不同的单倍型并不意味着来自于不同的父系，DC不等于非父排除率（PE）。本研究遗传学参数结果表明，30个Y-STR基因座复合扩增体系所用的基因座具有较好的遗传多态性和较低的突变率，平衡了多态性与突变率的关系，在家系排查中尽可能确保在较高DC的前提下减少了同一家系成员因快速突变基因座造成错误排除的风险。

综上所述，本研究30个Y-STR基因座复合扩增体系适合中国汉族男性人群的法医学应用与Y-STR数据库的建设需要。