川陈皮素对糖尿病大鼠认知功能障碍的影响

张红蕊 王耕银 崔昌萌 黄 蕊 刘春梅 赵轶群 高晓红 李春霞 李 伟 郑 佳

(唐山市人民医院，河北 唐山 063000)

糖尿病认知功能障碍(DMCI)严重影响患者生活质量，很多学者认为发病机制与氧化应激、海马神经元凋亡有关。目前认为核因子E2相关因子(Nrf)2-抗氧化反应元件(ARE)信号通路与DMCI有关，其抗氧化应激作用是研究的热点。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)是该通路激活后大量产生的抗氧化蛋白，是谷胱苷肽(GSH)合成的关键限速酶之一，由调节活力、催化活力两部分亚单位组成。γ-GCS的含量活性改变可以直接影响GSH合成,转录表达水平升高时增强细胞的抗氧化应激能力，保护中枢神经。血红素氧合酶(HO)-1，也是Nrf2通路中重要的抗氧化蛋白酶。Caspase-12即凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸酶12，是内质网应激(ERS)诱导凋亡的关键分子，表达量的变化可以反映ERS的活性，川陈皮素(NOB)主要提取于中药陈皮中，同槲皮素共属多甲氧基黄酮类化合物，在抗炎、抗氧化、营养神经、肝保护〔1〕等方面有重要作用。本研究旨在探讨NOB对糖尿病大鼠海马γ-GCS、HO-1、Caspase-12表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 12周龄健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，40只，体重(300±20)g，由华北理工大学动物实验中心提供。按照华北理工大学动物实验伦理委员会有关条例进行实验操作。主要药物及试剂：NOB(陕西慧科生物科技有限公司)、链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)、β-actin抗体(北京中杉金桥)、兔抗γ-GCS、HO-1、Caspase-12多克隆抗体(美国 KPL公司)、抗体稀释液(碧云天生物科技研究所)、十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶试剂盒(碧云天生物科技研究所)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳液粉剂(碧云天生物科技研究所)等。仪器设备：Morris水迷宫及分析软件(中国医学科学院药物研究所研发)、体重秤、高速低温离心机、电泳转移槽和垂直电泳仪(北京六一仪器厂)、温控摇床(XMOOOLDR-MLM)(北京中西远大)、凝胶成像分析系统(FluorChen 5500)(美国Thermo)。

1.2建立模型 大鼠适应性喂养2 w。禁食不禁水16 h后，随机选取32只大鼠单次腹腔注射1%STZ(60 mg/kg)溶液〔由0.1 mol/L的枸橼酸缓冲液(pH4.4)配制，浓度为10 g/L〕，72 h后用血糖仪检测大鼠尾血非空腹血糖，两次血糖值均>16.67 mmol/L者视为造模成功，进入实验，余8只大鼠设为正常对照组，予等剂量缓冲液腹腔注射。

1.3分组及给药 将造模成功的32只糖尿病大鼠，按照随机数字表法分组：糖尿病组(n=8)，NOB高剂量组(n=6)、中剂量组(n=6)和低剂量组(n=6)，α-硫辛酸组(阳性对照组，n=6)。另8只大鼠设为正常对照组。选用NOB干预，按10 mg/kg,20 mg/kg 30 mg/kg剂量，分别予低、中、高三剂量组每日腹腔注射。阳性对照组每日予腹腔注射α-硫辛酸60 mg/kg。正常对照组、糖尿病模型组均予每日腹腔注射等量生理盐水。以上6组均每日给药1次，连续8 w。实验期间动物自由进食水，常规饲料喂养。

1.4Morris水迷宫实验 22周龄时，行Morris水迷宫行为学实验(由固定人员完成，并不了解大鼠具体分组情况)。(1)定位航行实验：在隔音及人工照明环境下，一共进行5 d的测试，每天记录大鼠的成绩。池水每天更换，约30 cm深，21～24℃水温。圆形水池高50 cm，直径214 cm，深30 cm，温度约20℃，用4个标记点把水池分为4个象限，选一象限放置圆形平台。大鼠面对池壁下水，记录其爬到平台时间。如果120 s内未到站台，则120 s为潜逃潜伏期。轮换进行，记录成绩。(2)空间探索实验：实验第6天时把平台撤走，记录120 s内大鼠在目标象限停留的时间。

1.5灌注取材 水迷宫实验结束后大鼠空腹过夜8 h。之后每组随机选取4只大鼠进行心脏灌注，予10%水合氯醛(3.0 ml/kg) 行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，行左心室插管，同时将右心耳剪开，用生理盐水灌注，至眼球肝脏变白时，以4%中性多聚甲醛灌注固定，快速将脑组织完整取出，并迅速分离海马组织，装到冻存管，用液氮冷冻后，放置于-80℃冰箱储存。

1.6Western印迹检测 (1)制备蛋白样品，将RIPA裂解液加到各组样本中，充分裂解后，离心并取出上清。按照BCA法对蛋白浓度测定。(2)SDS-PAGE电泳：加好蛋白样品后，恒压电泳直到溴酚蓝到凝胶底部时。(3)蛋白质转膜：通过半干转法把蛋白转移到硝酸纤维膜上。(4)封闭：取出膜后，封闭在3%牛血清白蛋白(BSA)-Tris-Hcl缓冲液(TBST)中，放在摇床上60 min。(5)孵育一抗：将1∶1 000稀释的一抗加入，4℃摇床上过夜。TBST漂洗。(6)孵育二抗：将稀释的二抗加入，室温条件下摇床上育60 min，TBST漂洗。(7)蛋白检测：膜上加增强化学发光(ECL)反应5 min。曝光胶片，显影、定影。用凝胶成像分析系统分析条带。

1.7统计学方法 应用SPSS17.0软件行方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1定位航行实验结果 在5 d的测试中，各组潜逃潜伏期均呈下降趋势。第2天开始，与正常对照组相比，糖尿病组逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，提示STZ诱导糖尿病大鼠学习记忆能力显著下降。从第3天开始，与糖尿病组比较，NOB各剂量组、阳性对照组潜逃潜伏期明显缩短(P<0.05，P<0.01)，以高、中剂量组变化更显著(P<0.01)，且高剂量与中剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2空间探索实验 与正常对照组相比，糖尿病组目标象限停留的时间显著缩短(P<0.01)；与糖尿病组相比，NOB各剂量组、阳性对照组目标象限停留时间均延长(P<0.05，P<0.01)，以中、高剂量组更为显著(P<0.01)，但未恢复正常，且高剂量与中剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。表明川陈皮素可以缓解记忆能力的损伤。见表1。

表1 各组Morris水迷宫实验中潜逃潜伏期、目标象限停留时间比较

与正常对照组比较：1)P<0.01;与糖尿病组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.3Western印迹检测结果 正常对照组海马CA1区γ-GCS、HO-1、Caspase-12低水平表达。糖尿病组海马CA1区γ-GCS、HO-1、Caspase-12表达水平较正常对照组明显增加(P<0.01)。与糖尿病组比较，NOB各剂量组、阳性对照组海马CA1区γ-GCS、HO-1表达明显升高(P<0.05，P<0.01),而Caspase-12表达均有所下降(P<0.05，P<0.01)，以NOB中、高剂量组变化最显著(P<0.01)，但高剂量与中剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

图1 各组海马CA1区γ-GCS、HO-1、Caspase-12表达

表2 各组海马CA1区γ-GCS、HO-1、Caspase-12的表达

3 讨 论

海马结构与学习记忆能力密切相关，研究认为DMCI时海马结构功能受损。高血糖可透过血脑屏障损害神经元而降低患者学习、推理、记忆等能力。自由基氧化应激损伤学说及ERS诱导凋亡是近年来研究的热点〔2〕，认为二者均与DMCI有关。

正常情况下GSH和80%的γ-GCS结合使细胞失活,在GSH减少时与其结合的γGCS释放就会增加,γ-GCS的水平随之升高。有报道〔3〕Nrf2-ARE信号通路激活可以减少GSH的消耗、神经兴奋性毒素等对神经元的损害，增加神经元的能量、氧化还原电位抑制性神经递质信号和代谢过程，起到保护中枢神经的作用。Nrf2是抗氧化应激反应中重要的转录因子，ARE与其相互作用，调节下游抗氧化蛋白的表达〔4〕，在减轻细胞损伤中具有重要的作用〔5〕，对糖尿病氧化应激脑损伤起到保护作用。莱菔硫烷可激活Nrf2-ARE抗氧化通路，上调下游的Ⅱ相酶如HO-1等的表达，清除自由基，减少脑皮质细胞凋亡及保护血-脑脊液屏障〔6〕。外源性或内源性应激激活Nrf2后，可以上调γ-GCS、HO-1表达水平。

内质网容易受机体内环境的影响，氧化应激即可破坏内质网的稳态，导致未折叠蛋白的聚集或者错误折叠，从而引发未折叠蛋白反应。此反应一定程度上有保护作用，但是过度时将通过ERS导致相关性细胞凋亡。Caspase-12是ERS通路中一种重要的调控蛋白，位于内质网膜上。其表达水平在脑缺血再灌注损伤后明显升高。高糖可使ERS反应激活，活化的Caspase-12可激活Caspase-3、Caspase-9引起细胞凋亡。NOB有抗炎、抗氧化〔7〕、抗癌、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化〔8〕等作用。有报道〔9〕黄酮类化合物甘草黄酮也可以增强糖尿病大鼠抗氧化能力，降低丙二醛(MDA)水平，可推断NOB在糖尿病大鼠DMCI中可具有此作用；枳实、陈皮含有NOB、桔皮素活性成分，对缺血性脑卒中有一定的预防作用；研究〔10〕提出，NOB可以减轻大鼠脑缺血后脑水肿、神经功能受损而保护中枢神经；NOB可改善阿尔茨海默病大鼠的认知功能,有效改善脑缺血导致的认知功能下降。

本实验结果显示，正常对照组大鼠海马神经元中有少量的γ-GCS、HO-1、Caspase-12的表达，考虑为生理状况下的表达量。糖尿病大鼠出现严重的认知功能障碍，学习记忆能力损伤严重，表现为大鼠潜逃潜伏期延长、在空间探索实验中目标象限停留时间缩短，海马CA1区γ-GCS、HO-1、Caspase-12表达量较正常组升高，一方面考虑是大鼠高血糖透过血脑屏障，导致氧化应激增强产生大量有毒物质从而损伤了海马神经元；另一方面是高糖致ERS诱导海马神经元的凋亡，活化的Caspase-12表达水平上升进一步激活其他凋亡因子的表达而损害神经元。这种情况下，机体启动Nrf2-ARE通路，转录因子Nrf2活性增强、表达增多，通过与ARE作用，增加γ-GCS、HO-1等表达，抵御氧化应激对神经元的损害。NOB治疗大鼠认知功能改善，γ-GCS、HO-1表达量升高，NOB可能会使γ-GCS、HO-1表达增多而增强组织细胞抗氧化能力，保护海马神经元；Caspase-12表达水平下降，表明NOB可以抑制海马细胞凋亡，减轻认知功能损伤，机制可能与过度的未折叠蛋白反应中下调Caspase-12表达量等有关。将来可细化NOB的药物作用浓度，更深入地探讨NOB对DMCI的作用强度的曲线变化。

综上，NOB对改善糖尿病大鼠认知功能障碍有较好的作用，表明NOB可以保护海马神经元，机制可能与Nrf2-ARE信号通路激活导致γ-GCS、HO-1等抗氧化应激因子大量表达及抵抗在过度的未折叠蛋白反应中Caspase-12途径所致的细胞凋亡相关。