SIRT2对白细胞介素-1β诱导的兔关节软骨细胞凋亡的影响

范忠诚 王琮仁 李 杨

(中南大学湘雅医学院附属海口医院骨科，海南 海口 570208)

骨关节炎作为一种退行性疾病，以软骨细胞异常减少、基质降解增多为主要特性，软骨细胞占软骨组织的5%左右，具有维持软骨组织内环境稳定、保持软骨组织完整性的作用，其凋亡增多是骨关节炎发生的机制之一〔1〕。氧化应激、物理因素、炎症因子等都可以诱导软骨细胞凋亡，正常情况下，软骨组织中存在少量的白(IL)-1β，而在关节炎患者的软骨组织中存在大量IL-1β，IL-1β是诱导软骨细胞凋亡的重要因子〔2，3〕。沉默信息调节因子(SIRT)2是一种组蛋白去乙酰酶，依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，能够调控细胞能量代谢、增殖、凋亡等过程，其与关节炎的发生有关，在关节炎小鼠的软骨组织中发现SIRT2 mRNA和蛋白水平均下调〔4～6〕。本实验以兔膝关节软骨细胞为对象，研究SIRT2在IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 新西兰大白兔6只，雌雄不限，2月龄，购自长沙市开福区东创动物科技服务部。SIRT2过表达慢病毒由北京合生基因构建；0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco；Ⅱ型胶原酶、MTT、IL-1β购自美国Sigma；DMEM/F12购自美国Thermo；细胞色素(Cytochrome)C抗体购自美国CTS；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD；Realtime PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒购自大连宝生物；SIRT2抗体购自美国Abcam；胞质蛋白提取试剂盒、线粒体蛋白提取试剂盒购自上海生工。

1.2兔膝关节软骨细胞分离培养 步骤如下〔7〕：2月龄的新西兰大白兔，共6只，雌雄不限，购自长沙市开福区东创动物科技服务部。耳缘静脉注入空气将大白兔处死，无菌条件下取出膝关节，于超净台内用尖刀刮取膝关节软骨组织，剪成1 mm3的小块，加入5 ml 0.25%胰蛋白酶，于37℃恒温水浴箱内消化40 min，离心，弃掉上清，加入5 ml DMEM/F12培养基(含有0.2% Ⅱ型胶原酶)，于37℃恒温水浴振荡器150RPM消化6 h，100 μm的无菌滤筛将残渣除去，计数，等体积在培养瓶分装，倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况，观察到细胞贴壁后，每2天换液1次，细胞达80%～90%生长融合时进行传代。选择第3代细胞进行实验研究。

1.3细胞分组 取第3代兔膝关节软骨细胞，分为：Control组、IL-1β组、NC+IL-1β组、SIRT2+IL-1β组共4组，IL-1β组、NC+IL-1β组、SIRT2+IL-1β组细胞在实验开始时在细胞培养液中添加10 ng/ml IL-1β，SIRT2+IL-1β组、NC+IL-1β组细胞分别为感染SIRT2过表达慢病毒和对照慢病毒的兔膝关节软骨细胞。Control组、IL-1β组细胞在培养24 h以后，用于后续实验。慢病毒感染方法简述如下：取第3代兔膝关节软骨细胞，接种到6孔细胞培养板内，细胞培养密度为50%时，加入慢病毒液，MOI=10，培养3 d后，将细胞培养板置于荧光显微镜下，观察GFP绿色荧光表达情况，细胞感染效率高于95%，筛选稳定感染的细胞株，给予IL-1β刺激后，用Realtime PCR和Western印迹方法检测SIRT2表达。

1.4Realtime PCR检测SIRT2表达 Control组、IL-1β组细胞按照上述方法培养以后，以RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，RNA用DEPC水溶解以后，取1 μl的RNA，稀释200倍，用紫外分光光度计检测OD260nm/OD280 nm的比值。以RNA作为模板，用cDNA合成试剂盒合成cDNA。取1 μl的cDNA，进行Realtime PCR，步骤同Realtime PCR试剂盒，PCR体系为：12.5 μl的2×SYBR Green qPCR混合物，1 μl的上下游引物(5 μmol/L)，1 μl的cDNA模板，添加9.5 μl的ddH2O。引物为：SIRT2正义链5′-CAACCTGGAGAAATACCGTCTT-3′，反义链5′-CAGTCCTTTTTCCTTCAGCAG-3′。β-actin正义链5′-AGTGCGACGTGGACATCCG-3′，反义链5′-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG-3′。

1.5Western印迹检测SIRT2表达 Control组、IL-1β组细胞按照上述方法培养以后，在细胞中添加含有1 mmol/L的PMSF的细胞裂解液，将细胞裂解以后，转移到EP管中，12 000 r/min离心10 min，吸取上清溶液，保存在-20℃。用BCA法对蛋白进行定量检测。取蛋白样品，进行SDS-PAGE蛋白电泳，在上层胶中电压为80 V，在下层胶中电压为120 V，每个上样孔添加30 μg蛋白样品。取出蛋白凝胶，以150 V的电压转膜1 h以后，蛋白转移到NC膜上。用5%的牛血清白蛋白将非特异性的位点封闭以后，再把NC膜放在1/500的一抗中，4℃过夜，NC膜再与1/3 000的二抗室温中孵育2 h以后，按照ECL显色试剂盒显色后，用Band Scan分析条带的灰度值，计算SIRT2灰度值/β-actin的灰度值。

1.6MTT检测细胞增殖 取感染慢病毒后的兔膝关节软骨细胞，接种到96孔板内，细胞接种的密度为5×104个/ml，按照Control组、IL-1β组、NC+IL-1β组、SIRT2+IL-1β组分组处理后，分别在24、48、72、96 h时取出培养板，在每个孔内加入MTT溶液约10 μl，置于37℃孵育4 h以后，把上清溶液吸弃，再加入150 μl的DMSO溶液，置于低速摇床上孵育10 min，置于酶标仪上检测490 nm的OD值。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 取感染慢病毒后的兔膝关节软骨细胞，按照Control组、IL-1β组、NC+IL-1β组、SIRT2+IL-1β组分组处理24 h以后，以胰蛋白酶消化，2 000 r/min离心10 min，把上清吸弃以后，添加上样缓冲液混合后，此时细胞浓度为1×106个/ml，转移到流式管中，添加5 μl的PI及Annexin V-FITC，置于室温中孵育25 min后，用流式细胞仪检测。

1.8Western印迹检测胞质和线粒体中CytochromeC蛋白水平 取感染慢病毒后的兔膝关节软骨细胞，按照Control组、IL-1β组、NC+IL-1β组、SIRT2+IL-1β组分组处理24 h以后，按照试剂盒提取细胞线粒体和胞质中的蛋白，以Western印迹方法检测CytochromeC蛋白水平，具体步骤同上，胞质蛋白以β-actin为参照，线粒体蛋白以Porin为内参。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验，单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1IL-1β诱导后SIRT2表达水平降低 关节软骨细胞经过IL-1β诱导处理以后，细胞中的SIRT2 mRNA和蛋白水平下降，提示IL-1β减少关节软骨细胞中SIRT2的表达，见图1，表1。

图1 IL-1β减少关节软骨细胞中SIRT2蛋白表达

2.2慢病毒感染促进IL-1β条件下关节软骨细胞中SIRT2的表达 经过IL-1β诱导处理以后，细胞中的SIRT2水平升高，提示成功构建了上调 SIRT2的关节软骨细胞，见图2，表2。

2.3SIRT2提高IL-1β条件下关节软骨细胞增殖活性 IL-1β处理后的关节软骨细胞的OD值明显降低，而过表达SIRT2后的关节软骨细胞经IL-1β诱导处理以后，细胞的OD值有所升高。过表达SIRT2拮抗IL-1β对关节软骨细胞增殖的抑制作用，见表3。

表1 IL-1β处理后关节软骨细胞中SIRT2水平

图2 慢病毒感染上调IL-1β作用后的关节软骨细胞中SIRT2的表达

表2 各组SIRT2 mRNA及蛋白水平比较

与IL-1β组比较：1)P<0.05

2.4SIRT2抑制IL-1β条件下关节软骨细胞凋亡 IL-1β处理后的关节软骨细胞的凋亡率〔(26.14±2.87)%〕明显高于Control组〔(6.25±0.47)%〕，而过表达SIRT2后的关节软骨细胞经IL-1β诱导处理以后，细胞凋亡率〔(15.28±1.65)%〕较NC+IL-1β组〔(27.42±2.49)%〕明显降低，过表达SIRT2减少IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡。

2.5SIRT2减少IL-1β处理后关节软骨细胞线粒体释放CytochromeC IL-1β处理后的关节软骨细胞线粒体中CytochromeC蛋白水平明显降低，而胞质中CytochromeC蛋白水平明显升高。过表达SIRT2后的关节软骨细胞经IL-1β诱导处理以后，细胞线粒体中CytochromeC水平有所升高，胞质中CytochromeC水平有所降低。过表达SIRT2抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞线粒体释放CytochromeC，见图3，表4。

1～4：Control组，IL-1β组，NC+IL-1β组，SIRT2+IL-1β组图3 SIRT2过表达减少IL-1β处理后关节软骨细胞胞质及线粒体中CytochromeC蛋白水平

表3 SIRT2提高IL-1β条件下关节软骨细胞增殖活性

与Control组比较：1)P<0.05；与IL-1β比较：2)P<0.05，下表同

表4 SIRT2过表达对IL-1β处理后关节软骨细胞胞质和线粒体中CytochromeC蛋白水平的影响

3 讨 论

骨关节炎的发生以软骨组织破坏、软骨变性、关节间隙变窄为主要特性，而作为软骨组织的唯一组成细胞，软骨细胞功能紊乱是关节炎发生的关键〔8〕。研究表明，骨关节炎发生常常伴随有软骨细胞凋亡过度等现象，软骨细胞受到炎症因子等的刺激后，细胞凋亡水平升高，细胞损伤加重〔9，10〕。IL-1β作为一种炎症因子，在骨关节炎患者中的表达水平升高，其可以诱导软骨细胞凋亡发生〔11〕。本实验结果表明，IL-1β处理后的关节软骨细胞的增殖活性降低，细胞凋亡增多，提示成功构建了IL-1β诱导的关节炎软骨细胞模型。

沉默信息调节因子基因家族(Sir2)是一类组蛋白去乙酰酶，其与哺乳动物Sir2同源的蛋白共同组成Sirtuin蛋白家族，Sirtuin蛋白家族含有7个蛋白成员，在不同的组织和器官中表达水平不同〔12～15〕。SIRT1参与软骨细胞炎症，可以提高软骨细胞抵抗氧化应激能力并减少软骨细胞炎症等，SIRT1在骨关节炎中发挥保护作用，目前研究表明，SIRT2和SIRT1一样，作为Sirtuin蛋白家族的成员，都含有较高的去乙酰化酶的活性，均在骨关节炎软骨组织中表达下调，SIRT2可能也参与关节炎软骨细胞损伤发生〔16～19〕。本实验结果表明，IL-1β诱导后的关节软骨细胞中的SIRT2表达水平降低，这与上述研究报道结果一致，均表明SIRT2可能参与骨关节炎的发生。

有研究报道表明，IL-1β可以通过激活线粒体途径诱导关节软骨细胞的凋亡，IL-1β能够促进线粒体中CytochromeC的释放〔20，21〕。线粒体凋亡途径又称为内源性凋亡途径，是细胞凋亡发生的重要分支，在几乎所有的哺乳动物凋亡中存在，其诱导细胞凋亡发生与CytochromeC有关，CytochromeC是一个重要的凋亡激活因子，正常情况下，CytochromeC多存在于细胞线粒体内，当细胞受到病理因素的刺激以后，线粒体膜通透性转换孔打开，线粒体内的CytochromeC释放至细胞质中，激活位于细胞质中的凋亡反应，诱导细胞凋亡发生〔22，23〕。SIRT2具有抗细胞凋亡的作用，沉默其表达后可以减少细胞凋亡的发生，在急性髓系白血病细胞、帕金森病细胞模型等中已经得到证实〔24，25〕。本实验结果显示，IL-1β诱导后的关节软骨细胞线粒体释放的CytochromeC增多，而过表达SIRT2后的关节软骨细胞经IL-1β诱导后，细胞凋亡率有所降低，线粒体释放的CytochromeC减少，细胞增殖活性升高，说明SIRT2可以通过线粒体途径减少IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡损伤，SIRT2在软骨细胞凋亡中发挥保护作用。

总而言之，SIRT2能够通过减少线粒体释放CytochromeC抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡，提高软骨细胞活性，SIRT2可能具有抗骨关节炎的作用，对于其作用机制还需要在以后进行验证和探索。