丁基苯酞抑制晚期糖基化终产物诱导的内皮细胞损伤及其机制

赵振华 陈枝挺 刘昌云 吴小敏 李元霄 林汉斌 车春晖 黄华品

(福建医科大学省立临床学院 福建省立医院神经内科，福建 福州 350001)

脑梗死、心肌梗死、下肢动脉硬化闭塞症等是2型糖尿病最常见的并发症和最主要的死亡原因〔1〕。目前认为内皮功能损伤是动脉粥样硬化形成和进展的始动因素。在糖尿病状态下，升高的血糖与蛋白质、核酸或脂质发生非酶糖基化，形成具有极长半衰期的晚期糖基化终产物(AGEs)〔2〕。AGEs与内皮细胞膜上的糖基化终产物受体(RAGE)结合加速了活性氧自由基(ROS)生成，一方面导致血管内皮舒缩功能障碍，另一方面促进炎症因子表达升高，加快了糖尿病患者内皮细胞损伤，因此，AGEs的持续损伤是糖尿病血管并发症的重要触发因素〔3〕。如何对抗AGEs的促动脉粥样硬化作用一直是学者关注的热点〔4〕。

左旋丁基苯酞(L-3-n-butylphahalide)又名芹菜甲素(apium graveolens linn)，是从芹菜种籽中分离出的有效成分，根据其结构式，其异构体右旋丁基苯酞(d-3-n-butylphahalide)被合成。之后其混合物消旋丁基苯酞(NBP)作为临床药物被发展起来〔5〕。NBP能够通过多种途径减轻神经细胞缺血缺氧损伤，于2002年11月正式通过国家食品药品监督管理局的审批成为治疗脑卒中的临床药物,适应于脑梗死急性期治疗〔6〕。Li等〔7〕研究表明NBP对缺氧缺糖损伤的内皮细胞也有保护作用，能够抑制缺氧缺糖导致的氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡。但NBP对AGEs诱导的内皮细胞非缺氧缺糖损伤是否也具有保护作用尚未见相关报道。本研究建立AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)模型，采用不同剂量的NBP进行干预，并初步探讨NBP对内皮细胞的作用及其相应机制。

1 材料与方法

1.1材料 NBP(纯度99.6%)由石药集团恩必普药业有限公司赠送。HUVECs购自美国ATCC公司，MTT(美国Sigma公司)，胎牛血清(美国Invitrogen公司)，DMEM培养液和胰蛋白酶(Gibco公司)，Hoechst 33258染色试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)，荧光定量RT-PCR试剂盒(美国Promega公司)，Bax和Bcl-2一抗抗体(美国R&D公司)，β-actin一抗抗体(美国GenScript 公司)，相应二抗抗体(美国Sigma公司)，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，一氧化氮(NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA，美国Sigma公司)。

1.2AGEs的制备 5 g牛血清白蛋白(BSA)和9 g D-葡萄糖溶于0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.2)中，将配好的溶液通过0.22 μm的滤头过滤除菌后恒温37℃避光孵育12 w。相同条件下，以5 g BSA溶解于0.2 mol/L PBS(pH=7.2)中孵育作为对照。AGEs和BSA内毒素含量由内毒素检测试剂盒测定并确保<1.0 kU/L。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法检测AGEs浓度，加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基中配置AGEs终浓度为200 μg/ml。

1.3AGEs环境下内皮细胞培养及实验分组 HUVECs于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中常规培养于37℃、饱和湿度、5%CO2的恒温培养箱中。采用200 μg/ml AGEs对HUVECs进行干预，以200 μg/ml BSA作为正常对照组，AGEs干预组根据不同的NBP终浓度分为0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L 5组，其中以NBP终浓度 0 μmol/L组为阳性对照组。用于实验的内皮细胞接种于6孔板培养基，待细胞贴壁后分别加入不同浓度NBP共培养0.5 h。然后加入200 μg/ml AGEs或 BSA再培养48 h。

1.4MTT法测定细胞增殖率 取不同处理的细胞，调整细胞浓度为1×105ml种植于96孔细胞培养板，每孔100 μl，每组设3个复孔，于37℃、5%CO2培养，待细胞生长融合至70%～80%时开始实验。每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h后，小心吸弃培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，室温振荡10 min至蓝紫色结晶完全溶解，用酶标仪于波长490 nm处测吸光度OD值。

1.5HUVECs凋亡检测 在培养板中将已制备完成的细胞爬片用1×PBS浸洗3次，用4%多聚甲醛固定细胞爬片15 min，再用1×PBS浸洗细胞爬片3次，吸干多余的PBS。加入Hoechst 33258工作液染色，室温培育15 min，再用1×PBS浸洗细胞爬片3次，吸干多余的PBS后，用含抗荧光猝灭剂的封片液封片；然后在激光扫描共聚焦显微镜下采集图像。

1.6蛋白印迹试验(Western印迹) 检测各蛋白质表达用冷的PBS洗涤细胞3次后，于细胞裂解液中重悬细胞，冰上裂解30 min，4℃，8 000 r/min离心10 min，将上清液转移到新的EP管，用改良的Lowry法进行蛋白定量。各组取等量的蛋白上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭，用相应稀释后的一抗4℃孵育过夜，1×TBST漂洗3次后加入相应二抗，室温孵育2 h，化学发光法进行显色，对条带进行吸光度积分扫描。β-actin作为内参照。Bcl-2和Bax蛋白表达采用目标蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

1.7流式细胞学检测细胞内ROS含量 各实验组细胞弃去培养液，加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，以DMSO作为溶剂对照，37℃孵育细胞30 min，每3 min颠倒混匀，使探针与细胞充分接触。弃去培养液，用PBS洗涤3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。0.25%胰酶消化细胞2 min，加入培养基终止消化，3 000 r/min离心5 min收集细胞，用PBS洗涤2次，收获1.0×106细胞悬液。使用485 nm激发波长，525 nm发射波长，流式细胞仪检测ROS。

1.8NO检测 采用硝酸盐还原法。弃去细胞培养上清，用细胞刮将细胞刮下，加入提取液0.5 ml，混匀2 min，将细胞破碎制成细胞悬液，取样0.1 ml依照试剂盒说明操作，反应完成后，采用酶标仪分析，比色波长为550 nm。NO含量(μmol/L)=(测定OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准品浓度(20 μmol/L)。

1.9RNA提取和实时荧光定量PCR 收获1.0×105细胞，弃去培养液，Trizol法提取总RNA。采用逆转录试剂盒(Western biotechnology)合成cDNA。采用SYBR-GREEN PCR试剂盒扩增eNOS、iNOS和β-actin。β-actin上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',下游引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，iNOS上游引物:5'-GGGACCCGCACCACTACA-3',下游引物:5'-AGATTCTGCCGAGATTTGAGC-3'，eNOS上游引物:5'-GACCCTCACCGCTACAACATC-3'，下游引物:5'-CACGATGGTGACTTTGGCTAG-3'。采用相对定量法分析eNOS和iNOS的表达量。表达量=2-(Ct干预组-Ct内参基因)-(Ct正常对照组-Ct内参基因)，Ct：阈值循环数。

1.10统计学分析 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组HUVECs细胞增殖率比较 AGEs诱导后阳性对照组细胞增殖率明显下降至(62.27±2.56)%，与正常对照组100.00%比较差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组细胞增殖率分别为(64.61±1.80)%、(66.76±2.12)%、(70.09±1.66)%和(73.56±1.98)%。其中，1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，100.0 μmol/L NBP组与0.1、1.0 μmol/L NBP组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Hoechst 33258染色结果示，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，细胞质内含有大量浓染致密的颗粒块状荧光。阳性对照组异常染色的细胞明显增多，随着NBP干预浓度的增高，这些颗粒明显减少。见图1。

图1 各组HUVECs细胞Hoechst 33258染色(×200)

2.2各组凋亡蛋白表达比较 AGEs诱导后，阳性对照组Bcl-2蛋白表达较正常对照组明显降低(0.77±0.16 vs 0.29±0.02)，差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组Bcl-2蛋白表达逐步升高(0.29±0.42、0.39±0.02、0.43±0.05、0.54±0.01)，其中10.0 μmol/L和100.0 μmol/L NBP组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

AGEs诱导后，阳性对照组Bax蛋白表达与正常对照组相比明显升高(0.80±0.08 vs 0.32±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0 μmol/L和100 μmol/L NBP组Bax蛋白表达逐步降低(0.76±0.09、0.67±0.07、0.55±0.02、0.45±0.02)，其中1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组与阳性对照组差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组Bcl-2和Bax蛋白表达情况

2.3各组ROS比较 AGEs诱导后，阳性对照组ROS生成的荧光值为(763.0±33.8)，与正常对照组(93.0±4.6)比较差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组荧光值逐渐降低(366.0±16.1、203.7±6.4、155.00±5.6、141.0±3.6)，与阳性对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.4各组eNOS、iNOS mRNA及NO比较合成 AGEs诱导后，阳性对照组eNOS表达明显减少至正常对照组的(0.286±0.072)倍，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组eNOS表达逐渐增加，分别为正常对照组的(0.29±0.07)倍、(0.47±0.09)倍、(0.62±0.05)倍和(0.87±0.30)倍，其中10.0和100.0 μmol/L NBP组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

AGEs诱导后，阳性对照组iNOS表达明显增加至正常对照组的(3.94±0.56)倍，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组iNOS表达逐渐减少，分别为正常对照组的(3.78±0.38)倍、(3.10±0.97)倍、(2.29±0.46)倍和(1.74±0.55)倍。其中，10.0和100.0 μmol/L NBP组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

AGEs诱导后，阳性对照组细胞内NO合成明显减少至(14.254±0.555)μmol/L，与正常对照组(20.263±0.820)μmol/L相比差异有统计学意义(P<0.05)。经NBP干预后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组NO合成分别为(14.273±0.163)、(15.646±0.257)、(16.485±0.322)和(18.568±0.567)μmol/L。其中，1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

本研究初步证实了NBP能有效抑制AGEs对内皮细胞的损伤。Hoechst 33258染色证实了NBP能够有效抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡。凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的相应改变进一步支持了NBP的作用。NBP降低了AGEs诱导的ROS生成，在0.1 μmol/L的NBP干预下细胞内ROS的生成即明显减少，且随着NBP浓度的升高，ROS生成也逐渐减少，表现出明显的剂量依赖性。内皮细胞功能障碍，特别是NO生物合成减少导致的内皮功能障碍，普遍存在于糖尿病患者中。这是糖尿病血管并发症的发生和进展的重要因素〔8〕。NO是内皮细胞功能的标志物之一，是体内最强大而有效的血管舒张因子。研究表明，糖尿病患者体内NO合成减少和活性降低，导致血管痉挛和异常收缩、诱发血小板聚集及血管增生〔3〕。张胜雷等〔9〕研究表明100 mg/L的AGEs能够导致人脐静脉内皮生成NO明显减少，且随着AGEs浓度的继续增加，NO生成进一步减少。本研究结果表明NBP能够有效缓解AGEs对HUVECs NO生成的抑制作用。

一氧化氮合酶是NO合成的限速酶，包括内皮型、神经型和诱导型。其中，eNOS主要存在于内皮细胞，是血管壁上NO的主要来源，eNOS脱耦联是内皮细胞NO下降和氧自由基升高的重要机制〔10〕。iNOS则是在各种细胞因子或内毒素刺激情况下才出现大量表达，导致NO大量产生和释放，进而直接损伤细胞〔11〕。既往研究显示动脉粥样硬化患者较健康对照人群体内NO 基础水平降低，表明一氧化氮合酶的最终效应仍然是以eNOS为主导〔12〕。Xu等〔13〕研究表明，AGEs可以作用于内皮细胞，通过降低eNOS的磷酸化和蛋白表达，从而降低eNOS的活性，减少NO生成，介导血管内皮细胞功能失调。本研究结果提示，调节内皮细胞NOS表达可能是NBP上调HUVECs NO生成的途径。

综上，NBP存在抗自由基，保护神经元，减轻线粒体损伤等多种药理学活性。NBP可能存在抑制AGEs诱导的内皮功能障碍的积极作用，抑制氧化应激损伤和调节NOS表达可能是NBP保护内皮细胞的机制。