益肾安宫方治疗复发性流产疗效及对患者外周血T细胞亚群和细胞因子表达水平的影响

陈瑞红，刘 琰，刘玉玲△

1.郑州大学第二附属医院(郑州 450003 )，2.郑州大学第三附属医院(郑州 450052 )

主题词 流产/中西医结合疗法 补肾剂/治疗方法 @益肾安宫方 疗效比较研究

复发性流产(RSA)主要指连续发生不小于2次的自然流产，是一种妇产科常见疾病，病因较为复杂，涉及内分泌、遗传、生殖道感染等方面，大部分原因不明[1-2]。相关研究表明，妊娠妇女体内会发生十分复杂的免疫调节过程，妊娠结局与外周血T细胞亚群分化失衡密切相关[3-4]，其中Th1/Th2细胞失衡学说最经典，近年来发现Th17/Treg这对免疫细胞同样会影响患者的妊娠结局。目前,临床上对RSA患者的常规治疗为黄体酮注射液，具有一定的保胎作用，但临床疗效不高。中医学认为，RSA属于“滑胎”范畴，主要特点为胚胎应期而下、且会反复发作，治疗的关键是补肾固胎[5]。益肾安宫方为一种中药制剂，具有益肾养阴、固胎防滑之功效[6]，但目前对于益肾安宫方用于治疗RSA患者的相关研究甚少。为此，本研究将探讨益肾安宫方用于治疗RSA患者的疗效及其对外周血T细胞亚群的比例和细胞因子表达水平的影响。

资料与方法

1 一般资料 选取2015年1月至2016年12月我院收治的89例RSA非孕期患者为研究对象，按照随机数表法分为治疗组和对照组，本研究已经我院伦理委员会审核并批准。治疗组：患者44例，年龄23～42岁，平均年龄(28.17±4.98)岁；平均体重(57.95±8.93)kg；在中医证型上属于肾虚血热型24例，脾肾两虚型20例。对照组：患者45例，年龄21～43岁，平均年龄(28.31±5.02)岁；平均体重(57.89±8.97)kg；肾虚血热型23例，脾肾两虚型22例。纳入标准：均符合RSA相关的诊断标准[7]的妇女；均有连续两次或以上的自然流产史，且末次流产发生时间不超过1年；内分泌正常，且对本研究知情同意者。排除标准：生殖道感染或畸形；患有重要脏器疾病或自身免疫病等；夫妇外周血染色体核型异常。两组研究对象的年龄、体重和中医证型上等均无统计学差异(均P>0.05)，有可比性。

2 治疗方法 其中对照组肌肉注射黄体酮20mg(国药准字：H33020828)进行治疗，1次/d，1周为1个疗程，持续治疗3周。治疗组在上述基础上给予益肾安宫方进行治疗，若患者为肾虚血热型，则给予益肾安宫I号方保阴煎加减，组方为：熟地黄、黄芩、生地黄、山药、炒白芍、桑寄生和盐续断各15 g，阿胶和墨旱莲各12 g，甘草5 g。若患者为脾肾两虚型，则给予益肾安宫II号方寿胎丸四君子汤加减，组方为：菟丝子30 g，熟地黄、炒党参、炒白芍、杜仲、桑寄生和盐续断各15 g，炒白术、阿胶和茯苓各12 g，甘草5 g。两种组方均为加300 ml清水煮沸，取药汁服用，1剂/d，每日分3次服用，1周为1个疗程，持续治疗3周。

3 疗效评价标准 对两组患者治疗后的妊娠结局进行随访记录，将宫内妊娠大于12周归为妊娠成功，分娩婴儿存活则为活产。采集两组患者治疗前、治疗3周后静脉血各2管，其中1管为5 ml不抗凝，离心后取上清液，通过ELISA法对血清中细胞因子IFN-γ、IL-17、TGF-β和IL-4水平进行检测，试剂盒来自美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司；另1管为8 ml放肝素抗凝管中，根据达科为公司给出的有关淋巴细胞分裂液操作说明书将外周血单个核细胞(PBMC)进行收集，加入乙酸肉豆蔻佛波醇、莫能霉素及离子霉素(均购自Gibco公司)进行刺激作用，5 h后收集细胞，对细胞表面CD4+分子、胞内IL-17、IFN-γ、IL-4和相应同型对照抗体进行染色作用，通过FACSCalibur流式细胞对Th1、Th17、Th2和Treg细胞比较进行检测；利用qRT-PCR技术检测T-bet、STAT-3、GATA-3、RORγt和FOXP3mRNA表达水平。所有操作均严格按照说明书进行。

结 果

1 两组患者治疗后妊娠结局比较 随访1年期间，治疗组35例妊娠成功，妊娠成功率为79.55%(35/44)，其中30例活产，活产率为85.71%(30/35)。对照组27例妊娠成功，妊娠成功率为60%(27/45)，其中17例活产，活产率为62.96%(17/27)。治疗组的妊娠成功率和活产率均明显大于对照组(χ2=4.022，4.302，均P<0.05)。

2 两组治疗前后T细胞亚群比例情况 治疗前两组Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例相比均无明显差异(均P>0.05)。经治疗，治疗组Th1和Th17细胞比例均明显低于对照组，Th2和Treg细胞比例均明显高于对照组(均P<0.05)，见表1。

3 两组治疗前后血清各细胞因子水平比较 治疗前两组IFN-γ、IL-4、IL-17和Treg水平相比均无明显差异(均P>0.05)。治疗后，治疗组IFN-γ和IL-17水平均明显低于对照组，IL-4和TGF-β水平均明显高于对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 两组治疗前后血清各细胞因子水平比较

4 两组各项其他指标比较 治疗前两组T-bet、GATA-3、STAT-3、FOXP3和RORγt mRNA表达水平相比均无明显差异(均P>0.05)。经治疗，治疗组T-bet、STAT-3和RORγt mRNA表达水平均明显低于对照组，GATA-3和FOXP3 mRNA表达水平均明显高于对照组(均P<0.05)，见表3。

表3 两组治疗前后T-bet、GATA-3、STAT-3、FOXP3和RORγt mRNA表达水平比较(×103)

讨 论

中医学将RSA归为“滑胎”，认为肾为胎元稳固之本，肾虚、冲任不固容易引发滑胎，所以治疗应以补肾固胎、养阴清热为主[8]。通过补肾来防止滑胎的治疗方式最早出自宋代《女科百问》。冯晓玲等[9]研究也表明，采用补肾活血法治疗Th1/Th2失衡的不明原因RSA患者可以有效提高治疗有效率。益肾安宫方是一种中药制剂，具有健脾养阴、益肾固胎的功效，应用于治疗不明原因RSA和先兆流产患者均已取得良好的临床效果[10]。本研究结果显示，治疗后随访1年期间治疗组的妊娠成功率和活产率均明显大于对照组，可见益肾安宫方治疗RSA患者可以有效改善其妊娠结果。针对肾虚血热型患者，益肾安宫I号方中的熟地黄、生地黄和黄芩可清热凉血、养阴安胎；山药和墨旱莲可健脾养胃、滋补肝肾；白芍和阿胶可补血敛阴；桑寄生和续断可补肾固冲；加甘草以调和诸药。全方温而不燥，共奏补肾养血、清热凉血、安胎固冲的功效。针对脾肾两虚型患者，益肾安宫II号方以菟丝子作为君药，该药味甘性平、善吸收他物之气以自养，具有益阴固阳、补肾壮筋的作用；组方中的党参、白术和茯苓可健脾益气；白芍和阿胶可补血敛阴；桑寄生和杜仲可补肾固冲；加甘草以调和诸药，共奏补肾健脾、气血调和、安胎固冲的功效。张伟等[11]研究也表明，益肾安宫方具有补肾健脾的功效，可改善胎盘功能，增加保胎有效率，临床疗效显著。

相关研究表明[12]，RSA患者的妊娠结局和T细胞亚群(Th1、Th2、Th17等)的分化失衡密切相关。其中Th1细胞主要分泌IFN-γ等细胞因子，其特异性转录因子为T-bet(T-box家族成员)，可诱导产生IFN-γ；Th2细胞主要分泌IL-4等细胞因子，其特异性转录因子为GATA-3(一种锌指蛋白)，可诱导IL-4的产生。转录因子对Th细胞极性分化具有非常重要的调控作用，其中T-bet对Th1细胞的发育具有促进作用，还会抑制IL-4的分泌，GATA-3则对Th2细胞的发育具有促进作用，两者可相互抑制。Th17细胞具有较强的促炎症作用，主要分泌IL-17等细胞因子，其特异性转录因子为STAT-3和RORγt；Treg细胞的特异性转录因子为FOXP3。Treg细胞与Th17细胞存在密切联系，其中TGF-β和IL-6是两者连接的关键：TGF-β含量较高时可将初始T细胞活化分化成Treg细胞；少量的TGF-β和IL-6又可将活化的初始T细胞表达RORγt进而分化成Th17细胞[13]。本研究结果显示，经治疗后，治疗组Th1和Th17细胞比例均明显低于对照组，Th2和Treg细胞比例均明显高于对照组，表明益肾安宫方治疗RSA患者可有效调节T细胞亚群分化失衡状态。且经治疗后，治疗组IFN-γ和IL-17水平均明显低于对照组，IL-4和TGF-β水平均明显高于对照组。可见益肾安宫方能够改善相应的细胞因子水平。通过检测患者T细胞相应的转录因子的表达水平，结果发现治疗后，治疗组T-bet、STAT-3和RORγt mRNA表达水平均明显低于对照组，GATA-3和FOXP3 mRNA表达水平均明显高于对照组。这进一步证实了益肾安宫方能够有效调节患者T细胞亚群分化失衡状态，这可能与益肾安宫方具有健脾养阴、调节气血、益肾固胎的功效有关[14]。

综上所述，益肾安宫方治疗RSA患者可以有效改善其妊娠结果，调节T细胞亚群分化失衡状态，并有效改善相应的细胞因子水平及转录因子的表达水平。