丹郁消癖颗粒水煎提取工艺的研究*

蒙麦侠，赵志国，陈志永，崔小敏

1.陕西省中医药研究院(西安 710003),2.西安市碑林区中医医院药剂科(西安 710002)

主题词 色谱法，高压液相 正交试验 提取工艺 丹郁消癖颗粒

丹郁消癖颗粒处方来源于临床乳腺专科大夫多年用于治疗乳腺增生病(Hyperplasia of mammary gland,HMG)的经验方。HMG是一种非炎症又非肿瘤的良性乳腺疾病，是临床常见的乳房疾病，该病好发于25～50岁的中青年妇女，发病率在育龄妇女中占40%左右，约占乳腺病的75%，居乳房疾病首位。随着城市生活节奏加快、社会压力增大、女性生活角色的转变以及生育情况的影响，发病率呈逐年提高。乳腺增生分为典型性和非典型性增生，后者被业内专家视为乳腺癌癌前病变的高度可疑信号[1-3]，因而引起相关医学及女性朋友的普遍关注。

该药处方由柴胡、丹参、益母草、赤芍、郁金、香附、莪术等药味组成，具有疏肝理气、活血化瘀，软坚散结之功，对肝郁气滞、痰瘀互结型乳腺增生有很好的疗效。乳腺增生病临床多以3个月为1个治疗周期，此方目前以汤剂形式用于临床，给患者带来服用量大、携带保存不便、依从性差、不能满足长时间服用等缺点，故确定结合现代技术手段将其制成无糖型颗粒剂。试验设计中以君药丹参中活血化瘀有效成分丹参素钠的转移率和干膏率为综合考察指标，采用正交试验法优选丹郁消癖颗粒的水煎提取工艺参数，为今后的规范化生产提供依据。

仪器与材料

1 仪 器 LC-2010A HT型高校液相色谱仪(岛津公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT 25S型电子分析天平(d=0.01 mg，赛多利斯科学仪器北京有限公司)；温控式电热套(1000、2000 ml，巩义市英峪予华仪器厂)。

2 材 料 丹参素钠(批号：110855-201412)，购自中国药品生物制品鉴定所；丹参、益母草、赤芍、郁金、柴胡等药材均购自陕西兴盛德药业责任有限公司，经陕西省中医药研究院中药鉴定与炮制研究室蒙麦侠副研究员鉴定均符合2015版中国药典规定；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

方法与结果

1 浸泡时间与吸水倍数考察 取试验处方量药材，加适量水至液面高出药材1 cm为止，记录加入水的体积，总量为药材量的6倍，每间隔一定时间观察一次浸泡程度，待全方药物浸透无干芯为止，记录浸泡时间后，药液滤过至尽，记录倾出液体积。试验结果表明：浸泡时间为1 h，吸水倍数为1.3倍，由此确定正交试验加水倍数定为6、8、10倍。

吸水倍数=(加入水体积-倾出液体积)/药材量

2 丹参素钠含量测定[4-6]

2.1 溶液的制备：对照品溶液制备取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.151 mg的溶液，即得。

供试品溶液制备：按处方量称取赤芍、柴胡、益母草、莪术等药材，置回流提取器中，按文中表2安排的试验方案回流提取，提取液滤过，合并，浓缩至500 ml，精密量取各项下浓缩液50 ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇适量溶解并转移至50 ml容量瓶中，超声处理30 min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

阴性样品溶液制备：称取处方量除丹参外的剩余药材，加10倍量水煎煮3次，每次2 h，提取液滤过，合并，其余同供试品溶液处理方法处理，制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性：色谱柱：Inertsil ODS-3(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.5%冰醋酸溶液(7∶93)；检测波长：280nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；理论塔板数：按丹参素钠计不低于3000。

系统适用性:在上述色谱条件下吸取丹参素钠标准品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果阴性样品色谱图显示在丹参素钠出峰位置无相应色谱峰出现，供试品色谱图显示丹参素钠色谱峰和相邻峰达到基线分离，表明选用的色谱条件适宜，阴性样品对丹参素钠的测定无干扰，试验结果见图1。

2.3 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标法计算丹参素钠含量，即得。

3 干膏率的测定 精密量取2.1项下的浓缩液50 ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，参照《中国药典》2015版四部2201之浸出物测定法，在105℃干燥3 h，置干燥器中冷却0.5 h，迅速精密称定重量，再干燥0.5 h，同前法放置及称定重量，计算是否干燥达到恒重，否则，继续干燥0.5 h，直至恒重，计算干膏重及提取干膏率。

干膏率=干膏重×10÷煎煮药材量

4 正交试验设计[7-8]在预试验的基础上，选取加水量、煎煮时间和煎煮次数为考察因素，以干膏率和丹参素钠含量为考察指标，选用L9(34)正交试验表。按处方量称取药材，共9份，照表1因素水平表和表2正交实验安排进行实验，药材加规定量水浸泡1 h后，提取相应时间和次数，合并提取液，滤过，浓缩至500 ml后按照上述测定方法测定丹参素钠含量和干膏率。正交试验因素水平见表1，干膏率方差分析见表2，丹参素钠含量方差分析见表3，正交实验安排和数据分析见表4。

A-丹参素钠标准品 B-供试品溶液 C-缺丹参阴性样品溶液

表1 正交试验因素水平表

表2 干膏率方差分析表

注：F0.1(2，2)=9.00 F0.05(2，2)=19.00 F0.01(2，2)=99.00

表3 丹参素钠含量方差分析表

注：F0.1(2，2)=9.00,F0.05(2，2)=19.00,F0.01(2，2)=99.00

从表2和表3数据可以得出：以干膏率为考察指标，煎煮次数的影响有极显著性影响意义，该因素的水平不可调整，加水量及提取时间的影响无显著性意义；以丹参素钠为考察指标，加水量和煎煮次数对其提取量有影响，但没有显著性意义。综合直观及方差分析结果，确定最佳提取工艺为A3B3C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

5 验证试验 称取处方量药材，三份，加水浸泡1 h，加10倍量水，煎煮3次，每次2.0 h，煎煮液合并，滤过，浓缩至500 ml，下按“干膏率和丹参素钠测定”方法进行，计算干膏率和丹参素钠含量，结果见表5，平均干膏率为26.85%，RSD为1.30%，丹参素钠平均含量为146.61mg，RSD为2.06%，说明优选工艺稳定，重复性好。

表4 正交试验安排和数据分析表

从表4数据直观分析可以得出各因素对干膏率的影响依次为：C>A>B，即煎煮次数>加水量>煎煮时间；对丹参素钠提取量的影响依次为：A>C>B，即加水量>煎煮次数>煎煮时间；最优工艺为：从干膏率考察指标得出加10倍量水，煎煮2.0 h，煎煮3次；从丹参素钠考察指标得出加10倍量水，煎煮2.0 h，煎煮3次；两者优选出的结果一致。从直观分析最终确定最优提取工艺为：A3B3C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

表5 验证试验结果

讨 论

乳腺增生病是一种乳腺组织非炎性又非肿瘤的良性乳腺疾病。患者以乳腺肿块和胀痛为主要症状，是乳腺主质或间质不同程度地增生与复旧不全，造成乳腺结构在数量及组织形态上表现异常的一类疾病，是以腺泡上皮、导管上皮及纤维结缔组织增生为主要病理改变的乳房疾病。

现代医学认为乳腺增生病主要由外界不良因素如长期的精神紧张、过度劳累及晚婚晚育等而致使机体内分泌紊乱所致，如雌二醇绝对或相对增高，孕酮分泌相对或绝对不足，导致E2/P比例失调，孕酮失去制约雌二醇与保护乳腺组织的作用，致使雌激素持续对乳腺组织不良刺激，从而引起乳腺增生病。

传统医学认为该病属于中医的乳癖范畴，主要由人体脏腑、经络、气血、津液、阴阳失调而引起的生理功能和结构发生异常的一类疾病。乳房位于胸中，为“宗经之所”；其中，足阳明胃经(乳中穴)贯乳中；足厥阴肝经上贯膈，布胸肋，绕乳头；足少阴肾经从肾上贯肝膈，入肺中，支脉入胸中而与乳联；足太阴脾经上贯膈，经于乳外测；任脉行于两乳之间，冲脉挟脐上行，至胸中而散。因此生理上乳房受脏腑、经络、气血、津液所养，在“肾-天癸-冲任”性轴的协调作用下完成各项生理功能。因此乳腺增生的发病与肝、脾、胃、肾经及冲任二脉关联最为密切，上述脏腑经络功能失调皆可治病。历代中医学者认为该病的病机主要责之于肝气郁结、脾虚痰阻、肾阳不足、冲任失调，进而会使机体形成气滞、痰凝、血瘀等症状。病位在肝脾肾，病性是本虚标实，其发生发展是一个因虚致实、因实而虚、虚实夹杂的复杂过程[9-10]。丹郁消癖颗粒处方重用活血理气通络之品，使患者气滞可解，淤血可化，经络可畅，故活血化瘀药在该方中起着重要作用。

丹参为丹郁消癖颗粒方中君药，味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕积聚、胸腹疼痛等；文献资料[11-15]报道所含水溶性成分丹参素具有扩张冠状动脉，抗血小板凝聚、动脉粥样硬化、血栓形成，促进血管新生等作用，对于改善乳腺增生瘀血症状发挥重要疗效，故工艺评价指标中对丹参素钠含量和干膏率双重指标给以评价。工艺考察结果中分别以丹参素钠和干膏率计算，优选出的最佳提取工艺参数方向性一致，故未采用分值比来计算。最后综合直观分析和方差分析结果，确定提取工艺为处方药材加10倍量水、浸泡1 h、提取3次，每次2 h，经验证表明优选工艺稳定可行。