头痛宁胶囊对偏头痛大鼠血清中NO、脑组织中5-HT、β-EP的影响*

盛 刚,张雪慧，郭 珍

1.陕西省中医医院(西安 710003)，2.陕西中医药大学附属医院(咸阳 712000)

主题词 偏头痛/中西医结合疗法 @头痛宁胶囊 β-内啡肽 一氧化氮 动物实验 大鼠

偏头痛是一种常见的临床头痛，其特征为阵发性，大多疼痛位置位于偏侧，程度为中度至重度，形式多为搏动样头痛，通常持续4～72 h，发病时伴随症状可有恶心、呕吐，通常光、声刺激或日常活动可加剧头痛，而安静的环境或者经过休息可缓解头痛[1]。频繁发作和程度严重的头痛，会严重影响患者的生活质量，造成患者学习能力及工作能力的下降。目前更加得到认可的偏头痛发病理论是CSD和三叉神经血管反射理论，前者是目前被认可的偏头痛先兆的重要机制，而后者可以更全面地解释偏头痛的病理生理过程并被广泛接受[2]。头痛宁胶囊源自清·陈士铎《辨证录·头痛篇》中“散偏汤”，是陕西省名中医杨秀清教授在中医理论指导下，在“散偏汤”基础上加减化裁研制而成的纯中药制剂，药物组成有川芎、生白芍、香附、地龙等九味药物。本文主要通过研究头痛宁胶囊对偏头痛模型动物的血清中一氧化氮(NO)和脑组织中5-羟色胺(5-HT)、β-内啡肽(β-EP)水平变化来评价其在偏头痛中的治疗作用。

材料与方法

1 实验动物 健康SD大鼠60只，雌雄各30只，(200±20)g。第四军医大学动物实验中心提供。适应性喂养7 d，按体重随机分成空白组、模型组、阳性对照正天丸组、头痛宁胶囊大剂量组、头痛宁胶囊中剂量组、头痛宁胶囊小剂量组，每组10只。

2 药物与试剂 头痛宁胶囊，由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供，配制成药物混悬液后根据大中小剂量组0.15，0.3，0.6 g/kg给药。正天丸，由三九医药股份公司生产，每袋净重6 g，按大鼠体重1.24 g/kg给药。戊巴比妥钠：上海国际集团化学试剂有限公司。盐酸：西安富力化学试剂厂。氢氧化钠：西安怡和化工厂。硝酸甘油注射液：北京益民药业有限公司生产，每ml含硝酸甘油5 mg。5-羟色胺免疫组化试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色剂：武汉博士德生物医药有限公司。NO硝酸还原酶法试剂盒：南京建成生物工程研究所。125I-β-内啡肽放射免疫测定试剂盒：解放军第二军医大学神经生物学教研室。

3 实验仪器 KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。OLYMPUS CX31型电子显微镜：日本OLYMPUS公司。DK-8A型电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司。KE-WEI电热恒温水浴锅：北京科伟永鑫实验仪器设备厂。723分光光度计：上海光谱仪器有限公司。FJ-2103γ免疫计数仪：西安二六二厂。石蜡包埋机：HISTOCENTRE，英国。石蜡切片机 ：FINESSE，英国。电子天平：瑞士产，由陕西中医药大学药理实验室提供。

4 实验方法 空白组灌胃0.9%氯化钠注射液10 ml/kg，阳性对照正天丸组按10 ml/kg灌胃正天丸；头痛宁胶囊大、中、小剂量组分别按10 ml/kg灌胃。各组动物每天灌胃给药1次，连续用药7 d。各组动物造模后30 min后分组给药1次，空白组不作处理。使用硝酸甘油建模方法。根据文献[3]报道的方法，SD大鼠皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg，建立实验性偏头痛动物模型，以造模30 min后大鼠出现双耳发红，频繁挠头，爬笼等烦躁表现为造模成功的标准。对照组大鼠皮下注射等体积生理盐水[4]。造模4 h后，腹腔注射 2%的戊巴比妥钠，按照 0.2 ml/100g 的剂量进行麻醉[5]。以4%多聚甲醛经心脏灌注固定后,断头取脑[6]，分离出下丘脑，置于称量杯中用电子天平称重。在沸生理盐水中煮5 min，以灭活酶，保持神经肽的稳定[7]。放入预冷的玻璃匀浆器中，加入 0.1N 盐酸 0.5 ml于匀浆器中匀浆，于 4℃ 条件下放置1h～2h，再用0.1N 的 NaOH 0.5ml中和，4℃离心(3000rpm )30 min，取上清液于 EP管中，-20 ℃ 冻存待测[8]。将脑组织包括脑干放入预冷的4%多聚甲醛液溶液中12 h，0.1M PBS 4℃过夜，然后置于梯度乙醇脱水，脱水后浸润蜡包埋，行冠状切片，切片厚度5 μm，每片组织切片间隔1 mm，置烘箱60℃ ，60 min干燥，保存试验[9]。

5 指标检测

5.1 一氧化氮(NO)、β-内啡肽(β-EP)、5-羟色胺(5-HT)含量检测： 严格按照试剂盒说明使用硝酸还原酶法测定血清NO，并用723分光光度仪测量血清中NO含量。NO检测在陕西中医药大学生物学实验中心完成。β-EP的检测按照β-内啡肽放射免疫测定药盒说明书的步骤进行，并用免疫计数仪测量下丘脑中β-EP含量。放射免疫检测在陕西中医药大学附属医院同位素室完成。5-HT的检测采用免疫组织化学SABC法。免疫组化检测在陕西中医药大学形态实验中心完成。

5.2 镜检： 荧光显微镜下：阳性细胞质棕色，主要为圆形或椭圆形，有黑色细胞核。 在高倍率(40×10)显微镜下观察每个切片的左上，右上，左下，右下和中心部分中的阳性细胞的数目，并计数阳性细胞的数目，并作统计学处理。

结 果

1 行为学改变 各组造模动物表现与文献报道一致[10]。除空白对照组外，其余组别建模10min左右，大鼠均出现双耳发红，频繁挠头、爬笼等烦躁表现。治疗组中的大鼠在给药后症状逐渐消失。上述现象模型组持续约3～4 h，然后出现蜷缩，活动减少的状态。

2 头痛宁胶囊对血清NO含量、脑干组织5-HT含量、下丘脑组织β-EP含量的影响

2.1 头痛宁胶囊对血清NO含量的影响:动物血清模型组中NO的含量增高明显,与空白组比较有统计学差异(P<0.01),说明造模成功。头痛宁大、中、小量组NO含量与模型组相比的均非常显著下降(P<0.01),头痛宁胶囊小量组与对照正天丸组相比无统计学差异(P>0.05)，见表1。

2.2 头痛宁胶囊对脑干组织5-HT含量的影响：模型组动物脑干组织中5-HT的阳性细胞数与空白组相比明显减少(P<0.01)。头痛宁大、中量组5-HT阳性细胞数明显增加,大量组与模型组、空白组相比有显著统计学差异(P<0.01),头痛宁中量组与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。而且头痛宁胶囊大量组比阳性对照正天丸组相比5-HT阳性细胞数显著增加更明显(P<0.01)。其他组别与正天丸组、空白组比较无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表1 头痛宁胶囊对血清NO含量的影响

注：与空白组相比，△P<0.01,☆P<0.05；与模型组相比，□P<0.01；与正天丸组相比,P>0. 05

表2 头痛宁胶囊对脑干组织5-HT含量的影响

注：与空白对照组相比，△P<0.01；与模型组相比，□P<0.01，☆P<0.05；与正天丸组相比，◇P<0.01

2.3 头痛宁胶囊对下丘脑组织β-EP含量的影响:模型组动物下丘脑组织中β-EP的含量与空白组比较无统计学差异(P>0.05)；除头痛宁大量组与模型组及空白组比较明显增高外(P<0.01),其余各组比较均无统计学差异(P>0.05)。然而头痛宁大量组与阳性对照正天丸组比却有非常显著性差异(P<0.01)，见表3。

表3 头痛宁胶囊对下丘脑组织β-EP含量的影响

注：与空白对照组相比，△P<0.01 ；与模型组相比，☆P<0.01 ；与正天丸组相比，◇P<0.01

讨 论

众所周知，NO在偏头痛和其他血管性头痛的机制中起关键作用[11]。其可通过扩张血管，引发神经源性炎症，激活损伤感觉神经元的敏感性，介导身体的疼痛信号传递，从而放大其生物学作用，导致疼痛的发生[12]。本实验为经典偏头痛模型，采用注射硝酸甘油后使动物血中NO的含量迅速增加，NO具有神经毒性作用，可刺激三叉神经-血管反射，引起脑血管扩张，导致偏头痛[13]。头痛宁大、中、小量组NO的含量明显减少(P<0.01)，与空白组比较没有差异，表明头痛宁胶囊可下调由硝酸甘油诱发的NO大量生成，减少由NO介导的无菌炎症和血管周围的神经毒性，从而缓解偏头痛的发作。

5-羟色胺(5-HT)既是神经递质，也是体液介质[14]。5-HT在偏头痛中的重要作用已经逐渐被认，偏头痛发作前血浆中的5-HT增加，不仅直接收缩血管，而且通过增加去甲肾上腺素的血管收缩作用，引起先兆期血管痉挛收缩[15]。头痛发作期，5-HT迅速代谢为5-HIAA，血中5-HT浓度比原来减少40%，5-HT的减少引起头皮血管反弹和偏头痛血管扩张性疼痛[16]。本实验硝酸甘油模型偏头痛大鼠血中5-HT含量明显下降，造模后使动物神经系统调节功能受到影响，使脑内5-HT大量释放，引起血管舒缩功能的异常，血管扩张，脑血流灌注量减少，诱发实验性偏头痛，而5-HT快速降解，导致脑中5-HT含量降低，导致模型组中5-HT阳性细胞数目的显著减少。该实验的结果表明，头痛宁大量组脑干5-HT阳性细胞数目明显增加(P<0.01)，说明头痛宁胶囊在一定程度上可阻止或延缓5-HT的降解，抑制伤害性信息的传入,并改善血管的舒缩功能障碍，因此调节由于5-HT诱导的血管收缩、舒张紊乱而延缓偏头痛的发作[17]。

β-内啡肽(β-EP)是α-内源性阿片肽，内源性阿片样肽具有强镇痛作用。 在体内内啡肽系统障碍的情况下，β-EP释放立即下降，而脑干蓝斑的抑制减弱，使各种血管活性物质增加，机体的疼痛阈值也下降，更容易发生偏头痛[18]。β-EP抑制P物质的释放,从而抑制脊髓和三叉神经管的原始神经感觉的疼痛[19]。本实验结果显示由NO诱发内源性阿片肽系统紊乱-β-EP功能紊乱。经过给药干预后，β-EP含量回升，表明头痛宁胶囊可上调由硝酸甘油诱导的β-EP产生的水平，其倾向于平衡生理状态，以达到缓解偏头痛发作和改善症状的目的。

头痛宁胶囊是陕西省名中医杨秀清教授在《辨证录》散偏汤的基础上加减而成，药用川芎、白芍、柴胡、香附、白芷、地龙等十味药组成。具有祛风清热、通络止痛的功效，用于治疗风热上扰，脑脉闭阻之头痛。方中川芎辛、温，归肝、胆、心包经，活血行气、祛风止痛，为血中之气药，能上行头目，下行血海，上达头面，外透肌肤，走而不守，为“诸经头痛要药”，为治头痛之要药。白芍苦、酸、甘，微寒。入肝脾血分，养血柔肝，泻肝经火邪，缓挛急止疼痛，《本草备言》：“补血，泻肝，益脾，敛肝阴。”白芷气味辛香走窜，与活血药配伍使用加强其活血作用，并能宣清窍，使窍通血活，而痛止。柴胡散瘀热、疏肝郁，为治疗少阳头痛之要药，香附，疏肝理气调经止痛，为理气良药，三者共为臣药，疏肝解郁，以助川芎、白芍行气止痛。佐以地龙清热熄风通络头痛。本研究中，皮下注射硝酸甘油注射大鼠制作实验偏头痛模型，结果表明，硝酸甘油注射后，大鼠血清N0、脑内5-HT、β-EP的含量都有明显变化，NO的含量呈增高趋势，而5-HT、β-EP含量呈下降趋势，头痛宁胶囊可以下调由硝酸甘油诱发的NO大量生成的水平，可以上调由硝酸甘油诱发的5-HT、β-EP的生成减少的水平，使其接近正常生化水平。这种作用的联合作用可以抑制一系列在偏头痛发作中的级联反应的恶性循环，并将有害物质降低到平衡水平的生理状态，从而产生止痛效应。由此可说明头痛宁胶囊可以调节身体的神经递质分泌，调节血管舒缩障碍，抑制伤害感受信息的传递，并在镇痛中起作用。