枸杞黄酮的研究进展

吴霞明

(甘肃省食品检验研究院，兰州 730030)

枸杞子具有滋肝润肺、益精明目、强健筋骨等功效。据中医记载，枸杞果实主治眩晕耳鸣、虚劳精亏、阳痿遗精、内热消渴、目昏不明、腰膝酸痛等症状[1-2]。现代研究发现，枸杞果实富含黄酮、多糖、色素、脂肪酸、挥发油、维生素、酚酸、甜菜碱、微量元素等多种成分[3]。随着对枸杞各种活性成分的不断研究，作为主要活性之一的枸杞黄酮也逐渐系统起来，其丰富多样的药理作用也慢慢被发现[3-9]。文章综述了近年来关于枸杞黄酮的研究进展，为今后枸杞黄酮的开发与利用提供科学依据。

1 枸杞黄酮的药理作用

枸杞黄酮的抗氧化作用不仅可以阻止细胞的退化、衰老，以及癌症的发生，还能改善血液循环，降低胆固醇。有些黄酮还含有PAF抗凝因子，对心脑血管疾病的抑制和改善有很大作用[3-10]。

1.1 抗氧化活性

1.2 抗肿瘤活性

黄元庆等[11]发现，枸杞黄酮对正常细胞的热能代谢有促进作用，而对小鼠L1210癌细胞的热能代谢有抑制作用，在枸杞黄酮浓度为4.1g /L时，对产热抑制率最大为44%。雷蕾等[12]利用体外培养的人肝癌细胞HepG2为研究对象，发现枸杞黄酮作用于HepG2时，可明显抑制HepG2的增殖，且在作用时间和剂量方面呈现出显著的依赖性。此外，随着作用时间的延长，枸杞黄酮在作用一定时间时，可促进HepG2中Bax和Caspase-3的表达，这2种蛋白正是促进HepG2促凋亡的蛋白。所以，枸杞黄酮抗肿瘤活性的作用机制为抑制肿瘤细胞增殖或者是诱导癌细胞凋亡，在有效上调促凋亡蛋白表达的同时还会破坏癌细胞的内稳态环境，继而再激活主导癌细胞凋亡的蛋白表达，最终引发肿瘤细胞凋亡。

1.3 调节生殖系统

为了研究枸杞黄酮对良性前列腺增生大鼠血清性激素的影响，杨丽等[13]建立模型，研究不同浓度的枸杞黄酮对前列腺重量、脏器系数、前列腺体积、睾酮浓度、雌二醇浓度、性激素结合球蛋白指标的影响，结果显示，240 mg/kg的枸杞黄酮就能让前列腺增生大鼠的前列腺体积减小，因为枸杞黄酮可以调节激素水平从而抑制前列腺增生。由此说明，枸杞黄酮对良性前列腺增生有明显的抑制作用。

1.4 其他药理作用

廖国玲等[14]以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象，建立H2O2诱导HUVEC的氧化损伤模型，来研究枸杞黄酮对氧化损伤的血管内皮细胞(HUVEC)中的一氧化氮和一氧化氮合酶的相互作用，表明枸杞黄酮对H2O2损伤的人血管内皮细胞有保护作用，且保护效果与枸杞黄酮呈一定的剂量依赖性。此外，还有研究揭示了枸杞黄酮的抗炎机理，因为肿瘤坏死因子(TNF-α)会激发细胞中炎症因子的表达，但是枸杞黄酮可以抑制炎症因子比如细胞黏附分子的表达，从而发挥良好的抗炎作用[9-16]。天然的枸杞黄酮类化合物多以苷类形式存在，由于黄酮与糖之间键合时因为各自种类、数量、键合位置及方式的不同，从而能形成功能多样、种类繁多的黄酮苷类，所以关于枸杞黄酮的键合机理及药理作用等方面还有很多研究空间。

2 枸杞黄酮提取技术的研究进展

目前报道的从枸杞中分离制备的黄酮类化合物主要有5种[17-18]，包括金合欢素、木犀草素、金合欢素-7-0-α-L-鼠李糖基(1→6)-β-D-葡萄糖苷、5，7，3’-三羟基-6，4’，5’三甲氧基黄酮、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖基(1→6)-β-D-葡萄糖苷等。枸杞中黄酮类化合物的结构种类复杂多变，既有水溶性的黄酮苷，又有醇溶性的黄酮苷元，以及伴生的复杂体系中其他化合物，所以筛选出优质高效环保的提取方法是枸杞黄酮应用于实际生产中的研究重点。

2.1 有机溶剂提取法

溶剂提取法是提取有效成分的重要方法之一，具有操作简单、设备要求不高等优点。由于枸杞中黄酮类化合物既有水溶性的黄酮苷，又有醇溶性的黄酮苷元，同时再考虑到其他化学溶剂残留而引发的安全性等综合问题，工业上首选食品级、药品级的乙醇作为枸杞黄酮的提取溶剂，而且，黄酮甙元类化合物适合用95%左右的高浓度醇提取，黄酮甙类化合物比较适合用65%左右的低浓度醇提取[19]。彭小敏[20]以总黄酮含量、芦丁含量为评价指标，利用L9(34)正交试验，优选出乙醇提取的最佳条件为料液比1∶30、提取温度80℃、提取时间30 min、乙醇浓度80%，提取1次，枸杞中总黄酮含量在8 mg/g以上，芦丁含量在0.7 mg/g以上。由于该方法的料液比和乙醇浓度都比较高，不仅加重溶剂回收负荷，而且大大增加生产成本，此外，提取温度也相对较高，这也会影响枸杞黄酮的部分活性。韩秋菊[21]在研究枸杞黄酮的提取中以黄酮提取率为评价指标，利用L9(34)正交试验，确定了乙醇提取枸杞黄酮的最佳工艺为料液比1∶10、提取温度80℃、提取时间4 h、乙醇浓度60%，提取率为17.1 mg/g。此方法相对之前的提取方法有所改进，但是依旧存在回收及生产成本方面的考虑因素，加之提取时间比较长和温度较高，这样不仅耗能较大，对所提取的枸杞黄酮的稳定性及活性也有不利的影响。吴韶梅等[22]使用索氏回流的方法，以总黄酮含量为评价指标，优化的提取工艺条件为乙醇浓度70%、料液比1∶26、回流提取3.5 h、提取温度87℃，得总黄酮含量为8.10 mg/g。相对而言，此方法料液比较大，而且提取时间较长，总黄酮得率也不是很理想，不利于枸杞黄酮的工业化生产。

溶剂提取法虽然具有操作容易、设备简单等优点，但是随着近几年来其他提取技术的发展，这种传统的提取方法所表现出的提取率低、提取物纯度低、溶剂用量大、耗时费力等劣势也就更加明显。所以，在传统提取方法的基础上继续创新改进就显得尤为重要。

2.2 微波辅助提取法

近年来，微波辅助提取(MAE)因为其独特性成为众多提取技术中运用较多的一项新辅助提取技术。MAE的原理是同时利用偶极子旋转和离子传导里外结合的方式加热萃取，所以微波萃取具有穿透力强、选择性高、受热均匀、节能省时、溶剂用量少、安全环保、提取有效成分质量高等特点[23]，因而成为高效优质提取食品和中药等有效成分的一项新技术。杨鹏等[24]以枸杞黄酮提取率为指标，利用L16(45)正交试验，优选出MAE法提取枸杞黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度70%、料液比1∶16、微波提取温度70℃、微波功率300 W、微波作用时间120 s，得总黄酮提取率为18.96 mg/g。此方法相比于有机溶剂提取法，不仅提高了提取率，还很大程度减少了提取时间，节能环保且高效。但是，微波提取产生的热效应，会在短时间内使溶液温度迅速增加，发生其他反应。对枸杞黄酮的相对稳定性及生物活性也有一定影响。张自萍等[25]以枸杞黄酮提取率为指标，利用L9(34)正交试验，确定微波辅助提取枸杞黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度80%、料液比1∶30、功率300 W、提取温度100℃、提取时间20 min，枸杞黄酮提取率为10.5mg/g。相较而言，此方法料液比过大，提取温度过高，微波处理时间相应增长，对枸杞黄酮的纯度、稳定性、活性等可能产生一定的影响，从而导致枸杞黄酮的提取率相对较低。史高峰等[26]以枸杞黄酮浸膏及其浸膏中总黄酮的含量为指标，利用单因素试验和正交试验(L9(34))，确定了提取枸杞黄酮的MAE法最佳工艺为96%工业乙醇、料液比1∶12、微波功率400 W、回流时间40 min。此法中枸杞黄酮浸膏得率达62.72 %、浸膏中总黄酮含量达2.69%、枸杞黄酮提取率为16.87 mg/g。此法虽然有所改进，但是离理想值还是有所差距。

微波辅助相比于传统有机溶剂提取法，不仅节约用时、降低耗能，还提高了枸杞黄酮的提取率，但是微波的穿透力和对物质产生由内到外的震荡热效应会让提取溶液迅速升温，从而加速溶剂蒸发，可能在这个过程中产生一些不利的反应从而降低枸杞黄酮的整体利用率[27]。因此，寻找更为高效的提取方法是研究重点。

2.3 超声波辅助提取

超声波辅助提取也是近年发展起来的一种辅助提取技术。刘敦华等[28]以枸杞黄酮得率为指标，利用单因素试验、响应面法，优化了超声波提取枸杞黄酮的工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶31、超声温度71℃、超声时间42 min，枸杞黄酮提取率为10.7 mg/g。从中可以看出，超声波辅助提取后，枸杞黄酮的整体提取效果有明显的改善。但是，该方法中的提取剂浓度和料液比都比较高，这不仅需要大量的溶剂回收过程，也会大大使生产成本增加。另外，此方法的超声温度和超声时间也相对较高，这也会影响枸杞黄酮的相对稳定性和活性。吴韶梅[22]以总黄酮含量为指标，通过L9(34)正交试验，确定了超声波提取枸杞黄酮的最佳条件为乙醇浓度50%、料液比1∶40、超声时间60 min、提取温度80℃，得枸杞总黄酮含量为9.38 mg/g。此法跟前面的方法相比，提取剂的浓度有所减小，但是料液比、提取温度、提取时间都较高，这些条件均对枸杞黄酮的含量及活性有影响，依旧达不到理想状态。韩秋菊等[21]在对比3种提取枸杞黄酮的方法中，以枸杞黄酮提取率为指标，利用L9(34)正交试验，确定超声辅助提取枸杞黄酮效果最好条件为乙醇浓度80%、料液比1∶30、超声功率80 W、超声时间15 min，其提取率为18.4 mg/g。此法不仅较明显地提高了提取率，而且在提取时间方面也占有一定的优势。

超声波萃取的原理就是利用超声空穴来破坏提取物的细胞壁，同时增加溶剂的穿透力来优化提取时间和提取效率，从而高效、快速地使提取物的细胞内容物溶解于提取溶剂中[29-30]，对提取物的结构和活性产生的不利影响也会大大降低。此外，超声波辅助萃取的有效成分杂质含量比较少所以易于纯化分离，而且其操作便捷[30]，综合经济效益显著。虽然通过超声辅助枸杞黄酮的提取率有所增加，但其溶剂量依旧过多，还是增加了溶剂的回收成本，而且整个过程中各种因素结合影响枸杞黄酮类化合物的结构稳定性和活性，依旧不利于工业化的生产[31]。

2.4 酶催化提取法

酶的高效催化技术近年来备受各行各业的关注，这一技术也被应用于枸杞黄酮的提取中，韩爱霞等[32]利用单因素试验，以枸杞总黄酮提取率为指标，采用酶催化法的最佳工艺为乙醇浓度40%、果胶酶浓度0.02 g/L、酶解pH 3.5、酶解温度40℃、酶解时间1.5 h，得总黄酮提取率为10.6 mg/g。水果加工中常用果胶酶来处理破碎果实，因为果胶酶能破坏细胞壁，从而加速果汁的出汁率[33]，同时还能提高汁液的过滤速度，增加汁液的澄清度和质感等。近几年，应用酶催化提取枸杞黄酮的相关研究也有所进展，相比于乙醇提取，酶催化提取的黄酮得率相对要高，但是，从酶的种类选择、含量控制、影响因素筛选等方面都还不够成熟，还需要继续不断改进和研究才能走向工业化生产。

2.5 磁场强化萃取法

周芸等[34]以枸杞果浆中黄酮提取率为指标，利用正交试验L14(45)，确定磁场强化萃取枸杞黄酮的工艺条件为640 mT的磁感应强度、40 min的磁化时间、65℃的磁化温度、60 min的浸提回流时间，此法使枸杞黄酮的提取率达到了2.91 mg/g。磁场强化萃取技术被称为“绿色分离技术”，是因为这种技术借助的是外加磁场来达到强化分离的过程，不仅可以利用磁场产生的特殊能量来改变抗磁性物质的微观结构，从而使其理化性质发生变化，而且还能同时促进反应速率达到强化萃取、离子交换、吸附、絮凝等过程[19，34-35]。虽然这一技术在其他领域运用较广泛成熟，但是对于枸杞黄酮的萃取而言依旧需要加强研究。

2.6 MAR纯化法

大孔吸附树脂(MAR)因为其自身球状、多孔的特殊性能常被当做吸附分离的高分子材料[19]。有人通过树脂性质、静态吸附、解吸附、动态吸附实验，从AB-8、D-101、X-5、NKA和ADS-7筛选最优树脂为D-101，60%乙醇为最优洗脱剂。并将枸杞黄酮含量从5.8mg/g提高到107.7mg/g。此方法操作简便、经济、纯化效率高，适合工业化推广[36-37]。贾韶千等[38]以枸杞黄酮含量为指标，采用静态吸附、解吸附实验，从AB-8、D101、HPD-100、HPD-600中优选了HPD-100为最优树脂，并通过动态吸附实验，确定了最优条件为上样浓度5.0 mg/mL、上样流速2.0 mL/min、洗脱液为50%乙醇溶液、洗脱速度1.5 mL/min，其枸杞总黄酮的纯度为785.3 mg/g，回收率为71.35%。此方法操作简单、经济，对枸杞黄酮吸附量大、纯化效果好、回收率较高，有着很好的应用前景。许亮等[39]以枸杞黄酮含量为指标，分析了各树脂(AB-8、NKA-9、XDA-1、HDP-100、HDP-600、S-8)的特点，选择了XDA-1为吸附枸杞黄酮用的最佳树脂，采用L9(34)正交试验，确定了枸杞黄酮吸附、洗脱条件为上样浓度0.25 mg/mL、流速0.5 mL/min、样品pH 5.0、洗脱溶剂为80%乙醇溶液、洗脱液用量5 BV，得枸杞黄酮含量为798 mg/mL，回收率为87.4%。影响树脂吸附的因素很多，主要有被分离成分的极性和分子大小、溶剂对成分的溶解性、溶液浓度及吸附流速度等。随着大孔树脂纯化分离技术的不断研究，枸杞黄酮的分离筛选条件也在不断改善。因为枸杞黄酮属于弱极性物质，所以要相对应的选择极性较弱的树脂[36-40]，上述文献中所选树脂都是弱极性或非极性树脂。此外，吸附和解吸附条件的选择直接影响着分离纯化工艺的好坏。

2.7 液相色谱纯化分析法

液相色谱技术具有高速、高效、高灵敏度的特点，但是由于其分离纯化效率太低，分离条件不易控制，此项技术还未广泛应用于分离纯化。董静洲等[41]建立了针对枸杞黄酮提取液进行色谱柱分离的条件：流动相A：1.0%乙酸；流动相B：甲醇；流速：1.0 mL/min黄酮。流动相(B)程序：0.00 min(0.1%)→ 10 min(0.5%)→ 30 min(95.0%)→ 50 min(0.1%)。并判断其为异黄酮。虽然目前的分离纯化技术有很多，但由于枸杞黄酮结构、化学性质的特殊原因，其分离纯化的方法还需要不断创新和探索。

综上所述，枸杞黄酮的提取纯化技术也在不断创新、不断改进，其研究还大有空间。但是，不管是传统的有机溶剂提取，还是微波、超声波辅助提取或是运用新的酶解技术还是磁场萃取技术，都存在或多或少不理想因素，所以在枸杞黄酮提取技术的研究道路上依旧需要不断探索，而且所有研究的目的都是为了寻找高效、节能、环保的提取技术并为工业化生产提供产品质量保证的方法。

3 枸杞黄酮的展望

枸杞黄酮作为枸杞果实中开发潜能极高的一种资源性物质，不仅应用于功能性食品和医药领域，还可以满足其他行业领域的市场需求，食品行业中作为天然添加剂，如保鲜中的天然抗氧剂、增味剂中的天然甜味剂、食品色彩中的天然色素等；农业领域中枸杞黄酮类物质被用于促进农作物的生长、农产品的增产，抑制细菌真菌类农作物病害，对抗旱涝、低温、干热等自然灾害等；在化妆品行业中，天然的枸杞黄酮因为其抗氧化、清除自由基等功效能发挥皮肤美白、抗衰老、再生等作用[42-43]。虽然枸杞黄酮的应用领域比较广泛，但大部分相关联的研究都仅徘徊于表型，而对于功能原理和活性机制方面的研究缺乏深度，因此，未来的研究若能针对枸杞黄酮的薄弱环节继续深入，则对其医药临床、食品保健、护肤化妆、绿色农药等市场可起到良好的指导作用[44]。同时，高效率、低能耗、高纯度的枸杞黄酮的研究也是今后开发工作的重点，为构建我国枸杞资源绿色循环和高效利用等综合发展模式提供科学借鉴。◇