SAPCD2对人结肠癌RKO细胞增殖能力的影响

(青岛大学附属医院病理科，山东 青岛 266003)

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，随着人口老龄化的加剧，其发病率持续增加[1-2]。近年来，人们在结直肠癌的分子诊断和靶向治疗方面取得了长足的进步，但是对于其具体的侵袭和转移机制仍不明确。因此，通过分子生物学的方法对结直肠癌的侵袭和转移机制进行研究，对于结直肠癌病人的临床治疗以及预后判断具有重要的意义。Suppressor Anaphase-promoting complex domain containing 2(SAPCD2)，又被称为p42.3或C9orf140，是哺乳动物体内一种新近发现的高度保守的基因，其影响细胞周期并参与染色体的分离[3-4]。相关的研究表明，SAPCD2基因在胃癌、胶质瘤、肝癌等多种肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤恶性程度及细胞增殖和侵袭性相关[3,5-9]。最近有研究发现，SAPCD2在结直肠癌中的表达显著增高[2,10]。然而，其在结直肠癌中过度表达的意义、分子机制及相关信号转导通路尚未阐明，而且SAPCD2在结直肠腺瘤中的表达情况尚未见报道。本研究拟首先采用免疫组织化学方法检测SAPCD2在结直肠正常黏膜、腺瘤及结直肠癌组织中的表达情况，分析其在三种组织中表达的差异性及其与临床病理参数的关系；然后采用慢病毒转染技术使SAPCD2在结肠癌RKO细胞中表达沉默，通过细胞功能实验研究SAPCD2的相关生物学功能，进一步探讨其对结肠癌RKO细胞增殖能力的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌RKO细胞系由浙江大学医学院分子病理学实验室提供。胎牛血清购于美国Ausbian公司，细胞转染试剂、细胞培养板以及DMEM培养基购买于美国Corning公司，慢病毒表达载体由上海吉凯公司构建，四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Genview公司，DMSO购于上海试一化学试剂公司，SAPCD2兔多克隆抗体(ab126342)购买自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1组织芯片和免疫组织化学染色 收集我院病理科2014—2016年接受手术治疗石蜡包埋的结直肠癌组织及匹配的正常黏膜组织标本108例，活检结直肠腺瘤标本50例(其中13例为108例结直肠癌中的腺瘤标本)，标本均经常规病理诊断确诊。

使用Pathology Devices TMAjrTM 制作孔径为 2.0 mm的组织芯片，3 μm厚切片，置于pH 6.0的枸橼酸中进行恒温水浴抗原修复35 min，用含体积分数为0.03的H2O2去离子水抑制内源性过氧化物酶10 min，滴加浓度为1∶1 500 的SAPCD2兔多克隆抗体4 ℃孵育过夜；滴加二抗酶复合物HRP试剂于室温下反应 20 min；通过DAB试剂对组织芯片显色，苏木素染色1 min，蓝化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。组织芯片SAPCD2的表达情况采用半定量评估的方法[10]，免疫组织化学染色的评分标准如下：①按照染色强度计分：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分；②按阳性细胞的百分比计分：阳性细胞百分比0为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，大于75%为4分。将两项得分结果相加：0～3分为低表达，4～12分为高表达。

1.2.2细胞培养、转染以及稳定细胞株的构建 转染前1 d将处于对数生长期的RKO细胞接种到6孔板上，5×104个细胞/孔，待细胞汇合达到20%时；吸除培养液，加入含病毒的培养液；12 h后更换为常规培养基继续培养；以pLV-shRNA SAPCD2为阳性对照，pLV-shControl为阴性对照，72 h后通过荧光显微镜观察，荧光率达到80%时，细胞状态正常，收集两组RKO细胞，通过RT-PCR检测两组细胞中SAPCD2敲减的效果。

1.2.3MTT实验 将处于对数生长期的两组细胞以2.5 g/L胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，并以1 000个细胞/孔接种到96孔培养板上；待细胞完全沉淀以后，以2 h间隔在显微镜下观察两组RKO细胞的密度，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养过夜；细胞贴壁后吸除培养液，每孔中加入5.0 g/L的MTT 20 μL；培养4 h后彻底吸除培养液，每孔加入100 μL的DMSO，然后振荡5 min，用酶标仪于波长490 nm处检测各接种板的吸光度(A)值；实验连续测定5 d，重复3次。

1.2.4克隆形成实验 将处于对数生长期的两组细胞以2.5 g/L的胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，并以1 000个细胞/孔接种于用6孔板培养板中，每隔3 d进行换液并观察细胞状态，在培养箱中持续培养8 d，吸除培养液；每孔加入体积分数为0.04的多聚甲醛1 mL，固定细胞30 min；每孔加入GIEMSA染液500 mL，染色20 min；用ddH2O洗涤细胞数次至洗脱液无色，晾干、拍照、克隆计数，实验重复3次。

1.2.5Celigo细胞计数检测 将上述的两组细胞以2.5 g/L胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液并计数；以1 000个细胞/孔接种到96孔培养板上，然后于37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养过夜；通过Celigo仪器检测读板1次，连续检测读板5 d；对数据进行统计绘图，绘制出5 d的细胞生长曲线。

1.2.6细胞周期实验检测 将两组细胞接种到6孔板上，细胞覆盖率达到80%时以2.5 g/L的胰酶消化，离心后收集细胞；用4 ℃预冷的D-Hanks(pH 7.2)洗涤后，离心；以4 ℃的含体积分数0.75乙醇固定细胞1 h后离心并洗涤细胞沉淀；加入PI细胞染液500 μL重悬，37 ℃孵育30 min，通过流式细胞仪检测细胞周期。

2 结 果

2.1 SAPCD2在各组织中的表达

与结直肠正常黏膜组织相比，SAPCD2在结直肠癌组织中的表达明显增高(图1)。结直肠癌组织中SAPCD2的表达与正常黏膜组织、腺瘤组织比较，差异有显著性(Z=-7.377、-6.204，P<0.01)；而在相对正常黏膜及腺瘤组织中的表达差异无显著性。见表1。对13例匹配的结直肠相对正常黏膜、腺瘤及结直肠癌组织三组相关样本分析，结果仍显示，结直肠癌组织中SAPCD2的表达与正常黏膜组织、腺瘤组织比较，差异具有显著性(χ2=14.170，P<0.05)。见表2。108例结直肠癌病人的临床病理资料显示，SAPCD2的表达与肿瘤的浸润深度相关(χ2=6.402，P<0.05)。见表3。

表1 结直肠癌、正常黏膜组织与腺瘤组织中SAPCD2表达

组1与组2采用非参数Mann-Whitney检验，组3采用非参数Wilcoxon检验。

表2 正常黏膜、腺瘤与结直肠癌组织中SAPCD2的表达

采用非参数Friedman检验。其中SAPCD2在正常黏膜与腺瘤组织的表达无显著差异。

2.2 敲减SAPCD2后人结肠癌RKO细胞的增殖和克隆形成能力

经shRNA慢病毒感染后，定量PCR检测显示，RKO细胞中SAPCD2 mRNA的表达水平明显降低(t=9.030，P<0.05)。MTT实验结果显示，第3～5 d与shControl组相比，SAPCD2敲减后细胞的增殖速度明显减慢(t=70.231～244.000，P<0.05)。见表4。克隆形成实验结果显示，shControl组及shSAPCD2组细胞克隆数分别为240±6、68±4，SAPCD2敲减后细胞形成克隆的数量显著减少(t=142.558，P<0.05)。见图2。Celigo实验结果显示，第2～5天，与shControl组相比较，SAPCD2敲减后细胞生长能力受到了明显抑制(t=4.856～22.869，P<0.05)。见图3、表5。

2.3 敲减SAPCD2对人结肠癌RKO细胞细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，SAPCD2敲减后，RKO细胞G1期构成比为(59.18±0.32)%，S期构成比为(21.92±0.31)%，G2/M期构成比为(18.90±0.14)%；shControl组RKO细胞G1期的构成比为(52.19±0.73)%，S期的构成比为(29.88±0.82)%，G2/M期构成比为(17.93±0.54)%。与shControl组相比，敲减SAPCD2后RKO细胞处于S期的细胞显著减少(t=22.378，P<0.05)，处于G1期的细胞显著增多(t=-26.368，P<0.05)。见图4。

3 讨 论

有研究表明，SAPCD2作为与细胞周期调控相关的新近发现的基因，只在肿瘤中表达而不在成人正常组织中表达，这种分子很可能是结直肠癌进展过程中重要的潜在的标记物，起到致癌基因的作用[2]。然而，SAPCD2对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响还存在争议[2,10-12]。因此，我们对结直肠癌标本及结肠癌细胞系进行研究，探索SAPCD2在结直肠癌发生发展过程中的作用以及其对结肠癌RKO细胞增殖能力的影响。

表3结直肠癌组织中SAPCD2表达与临床病理参数的关系(例(χ/%))

临床病理参数nSAPCD2表达高表达低表达χ2值P值性别 男6345(71.4)18(28.6) 女4530(66.7)15(33.3)0.2810.596 年龄(岁) ≥509365(69.9)28(30.1) <501510(66.7)5(33.3)0.0630.801 肿瘤部位 近端结肠1815(83.3)3(16.7) 远端结肠9060(66.7)30(33.3)1.9640.161 黏液腺癌 有119(81.8)2(18.2) 无9766(68.0)31(32.0)0.3540.552 分化程度 中分化+高分化7951(64.6)28(35.4) 低分化2924(82.8)5(17.2)3.3120.069 临床分期 Ⅰ+Ⅱ7250(69.4)22(30.6) Ⅲ+Ⅳ3625(69.4)11(30.6)0.000 1.000 浸润深度 T1+T21811(61.1)7(38.9) T33127(87.1)4(12.9) T45937(62.6)22(37.3)6.402 0.041 淋巴结转移情况 N07451(68.9)23(31.1) N12117(81.0)4(19.0) N2137(53.8)6(46.2)2.811 0.245远处转移情况 M010573(69.5)32(30.5) M1 32(66.7)1(33.3)0.000 1.000

a、b：结直肠正常黏膜组织，分别为100、200倍；c、d：结直肠癌组织，分别为100、200倍。

表5 SAPCD2基因敲减对RKO细胞生长能力的影响

图2 SAPCD2基因敲减对RKO细胞克隆形成能力的影响

图3 SAPCD2基因敲减对RKO细胞生长能力的影响

图4 SAPCD2基因敲减对RKO细胞细胞周期的影响

本研究结果显示，与结直肠正常黏膜相比，SAPCD2在结直肠癌组织中的表达明显增高，与相关的研究结果一致[2,10]。这说明SAPCD2的表达与结直肠癌的发生有着一定的关系，很可能是结直肠癌中一种新的潜在的标记物，但先前研究并未对SAPCD2在腺瘤中的表达进行深入探讨。而本研究结果显示，腺瘤中SAPCD2的表达与结直肠正常黏膜无明显差异，但与结直肠癌的表达却有显著性差异，SAPCD2的高表达发生在腺瘤产生之后，因此SAPCD2有可能是腺瘤癌变的一个启动基因，在腺瘤中进行SAPCD2的早期检测或许可以在一定程度上预测结直肠癌变的发生。对于SAPCD2在结直肠腺瘤恶变中的预测价值，仍需要进一步的研究。

SAPCD2与结直肠癌的临床病理特征的相关性在不同的研究中结果尚存在差异。WENG等[10]的研究表明，SAPCD2在结直肠癌中的表达与病人年龄、性别、肿瘤的部位、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关；YUAN等[2]研究显示，SAPCD2在结直肠癌中的表达只与肿瘤分化程度有关。本研究结果显示，SAPCD2的表达只与肿瘤的浸润深度有关，而与病人年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度、淋巴结是否转移等无关。这些差异有可能是样本人群年龄、性别分布、环境因素、检测方法和样本含量等的差异导致的，SAPCD2与临床病理特征的相关性还需要大样本量的研究进一步证实。

目前SAPCD2在结直肠癌中的分子机制及相关信号转导通路尚未阐明[13]。WENG等[10]研究发现，SAPCD2诱导结直肠癌细胞侵袭依赖于上皮-间质间的转化，通过增强STAT5与EZH2、β-catenin间相互作用进而加强对细胞的浸润；同时研究发现MiR-29a能够通过抑制SAPCD2阻滞细胞周期进而阻遏胃癌细胞的增殖[8]。YUAN等[2]研究认为，MiR-29a作为抑癌基因，在肿瘤中的表达普遍下调，在胃癌中可以通过抑制SAPCD2阻滞细胞周期，因此在结直肠癌中也可能通过抑制SAPCD2进而抑制细胞的增殖和侵袭。而且相关的研究发现，SAPCD2在胃癌细胞G1期和M期的表达明显增高，在G2期和S期的表达迅速减少[7,9]；MAO等[4]研究结果发现，SAPCD2在NIH3T3细胞G1早期和M期大量表达，在G1晚期、S期和G2期表达减少。本研究结果显示，敲减SAPCD2后G1期细胞显著增多，而S期的细胞显著地减少，说明敲减了SAPCD2可显著抑制人结肠癌RKO细胞的细胞周期中G1/S期的转换。细胞周期是细胞增殖与生长的关键调节因素，因此提示SAPCD2不仅能导致细胞的恶性转化，并能促进有丝分裂的加速和染色体的分离[4]。但XIONG等[11]研究显示，结直肠癌上皮-间质间的转化与STAT3、ZEB1的下调等有关，敲除STAT3可明显增加E-cadherin水平，同时降低N-cadherin，从而抑制结直肠癌中细胞侵袭性；而WENG等[10]认为，STAT3的敲除对SAPCD2没有任何影响。因此，SAPCD2在结直肠癌中的分子机制及相关信号转导通路仍需进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，SAPCD2的表达与结直肠癌的发生有着一定的关系，很可能是结直肠癌中一种新的潜在的标记物；SAPCD2在腺瘤与结直肠癌中表达的显著差异说明其有可能是腺瘤癌变的一个启动基因，在腺瘤中检测SAPCD2的表达情况或许可以在一定程度上预测腺瘤恶变的发生。另外，本研究通过体外细胞系实验也进一步证明，沉默SAPCD2可以抑制结肠癌RKO细胞的增殖能力。这些结果都说明SAPCD2在结直肠癌进展过程中扮演着重要的角色。