Vps28基因多态性与EBV相关肿瘤易感性的关系

(青岛大学，山东 青岛 266003 1 附属医院检验科； 2 医学院微生物学教研室)

EB病毒(EBV)是重要的DNA肿瘤病毒，与鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤等多种肿瘤的发生相关[1-6]。其中90%以上的低分化鼻咽癌(NPC)组织中可检测到EBV的存在，NPC发病存在家族聚集性、种族易感性及地域集中性。近年来，易感基因及病毒感染已逐步成为NPC发病的重要因素[7]，包括EBV基因在内的许多基因已被证实为NPC的易感基因，其多态性直接影响NPC的发病机制及病理类型[8-10]。Vps28是内吞体分选转运复合体(ESCRT)的组成结构之一[11]，ESCRT在细胞分选及降解泛素化膜蛋白这一过程中发挥重要作用，使一些激素、生长因子及细胞因子受体在与配体结合后内化并被溶酶体降解，导致受体表达下调，从而在信号衰减中起着重要作用[12-13]。表皮生长因子与受体结合导致受体活化，诱发信号转导，控制细胞的一系列功能，ESCRT在此过程中起到负向调节功能，其结构的变异可引起调节异常，导致肿瘤发生[14-16]。因此，探讨Vps28在EBV相关肿瘤发生机制中的作用具有实践指导意义。本文研究首次对EBV相关NPC(EBVaNPC)组织及EBV相关淋巴瘤(EBVaL)组织中Vps28基因rs2272658位点多态性进行检测，以期明确其多态性与EBV相关肿瘤的发生是否存在相关性。

1 材料与方法

1.1 材料来源

采用原位杂交技术检测105例NPC及136例淋巴瘤石蜡包埋组织切片中EBV编码的小分子非多聚腺苷酸EBER1的转录表达[17]，筛选出93例EBVaNPC组织，12例EBV阴性NPC(EBV-negative nasopharyngeal carcinoma，EBVnNPC)组织，87例EBVaL组织，49例EBV阴性淋巴瘤(EBV-negative lymphoma，EBVnL)组织。同时选取我院健康体检者100例作为正常对照组(NC组)。NC组均已排除各种感染、肿瘤及自身免疫病；各组间种族构成、年龄分布和性别构成在各病例组(包括鼻咽癌组及淋巴瘤组)与NC组间差异无统计学意义。

1.2 细胞DNA提取

NC组采集空腹静脉血5 mL，EDTA抗凝，分离外周血单个核细胞。采用QIAamp DNA FFPE试剂盒(Qiagen，德国)并按说明书提取石蜡包埋肿瘤组织DNA。外周血单个核细胞DNA提取采用酚-氯仿-异戊醇法，4 ℃保存备用。

1.3 Vps28基因rs2272658位点多态性的检测

利用AssayDesigner 3.1软件设计Vps28基因rs2272658位点的反应引物，引物序列如下：上游引物：5′-ACGTTGGATGAACTGTTCCTGAGGCAC-TCC-3′；下游引物：5′-ACGTTGGATGTAGAGCC-CAGAGTGCTACC-3′。根据实验体系依次进行PCR、SAP纯化反应及单碱基延伸反应，使用Sequenom公司的MassArray系统进行飞行质谱实验，通过分析软件MassArrayTyper 4.0进行处理，从而得到Vps28基因rs2272658位点在所有标本中的SNP分型。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行分析。采用χ2检验分析比较基因型和等位基因频率的分布差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组织中Vps28基因rs2272658位点多态性检测结果

在隐性模型当中，EBVaNPC组的TT基因型频率高于NC组(OR=2.07，95%CI=1.16～3.68，χ2=6.21，P<0.05)。EBVaNPC组的T等位基因频率明显高于NC组(OR=1.75，95%CI=1.13～2.72，χ2=6.26，P<0.05)。表明TT基因型为EBVaNPC的致病基因型，而T等位基因为EBVaNPC的危险因子。

EBVaNPC组中T等位基因及TT基因型频率均高于EBVnNPC组(OR=5.07，95%CI=2.08～12.36，χ2=14.71，P<0.01；OR=41.60，95%CI=3.88～447.56，χ2=18.79，P<0.01)。在隐性的模型中，EBVaNPC组中TT基因型的频率明显高于EBVnNPC组(OR=13.95，95%CI=1.37～112.53，χ2=9.63，P<0.01)。在显性模型中，EBVaNPC组CC基因型频率明显低于EBVnNPC组(OR=8.80，95%CI=1.962～39.47,χ2=10.60，P<0.01)。表明相对于EBVnNPC组，TT基因型以及T等位基因为EBVaNPC的危险因子。见表1。

2.2 淋巴瘤组织中Vps28基因rs2272658位点多态性检测结果

EBVaL与EBVnL以及NC组间Vps28基因rs2272658位点的基因型分布无统计学差异(P>0.05)；EBVaL与EBVnL组及EBVaL与NC组间T等位基因分布均无统计学差异(均P>0.05)。结果见表2。

3 讨 论

ESCRT是一类与肿瘤、神经病变性及感染性疾病关系密切的保守蛋白质，参与细胞增殖、分化、信号转导等多种生命活动的调控，与多种疾病的发生密切相关[18-19]，因此ESCRT的组件受损会引起一系列的疾病。4种蛋白Vps23、Vps28、Vps37、Mvb12构成了复合体ESCRT-Ⅰ，ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及Vps4 5个复合体进一步组成了完整的ESCRT。

表1 EBVaNPC组、EBVnNPC组及NC组的Vps28基因rs2272658位点多态性的分布(例(χ/%))

表2EBVaL组、EBVnL组及NC组的Vps28基因rs2272658位点多态性的分布(例(χ/%))

组别基因型频率CCCTTT等位基因频率CTNC组11(11.00)51(51.00)38(38.00)73(36.50)127(63.50)EBVaL组10(11.49)43(49.43)34(39.08)63(36.21)111(63.79)EBVnL组8(16.32)19(38.78)22(44.90)35(35.71)63(64.29)

研究证明，ESCRT能够参与病毒的出芽过程，调控细胞自噬。BLECK等[20]研究证实，ESCRT通路能够在HIV-I病毒颗粒组装时被聚集，并且参与新生病毒质膜分裂的过程，进而参与病毒的复制。有研究结果显示，DNA包膜病毒如疱疹病毒和杆状病毒等的出芽释放也依赖于宿主细胞的ESCRT系统，ESCRT可以协助EBV调整核膜结构，促进核酸释放[21]。

ESCRT-I中的Vps23，又称为Tsg101，是一种肿瘤易感基因，能够促进细胞分裂和增殖，加快细胞周期进程，促进体内病毒的运输，在人类多种肿瘤中高度表达，检测Tsg101可用于评估肿瘤恶性程度并为靶向治疗提供可能的位点[22]。CHUA等[23]报道，Tsg101能够与病毒裂解激活酶Rta反应，促进EBV的晚期基因激活，完成EBV的生产性裂解循环，具有Tsg101缺陷的细胞不能表达晚期病毒蛋白，导致病毒颗粒的产量降低。STUCHELL等[24]研究发现，Tsg101蛋白发生突变之后由于不能够与Vps28蛋白连接，因而使细胞具备了抑制HIV出芽的能力。因此可以推断，Vps28与肿瘤易感基因Tsg101关系较为密切，是病毒复制及其信号通路中不可缺少的一部分。Vps28的基因多态性亦有可能引起Tsg101功能的改变，进而影响病毒相关肿瘤的易感性。

WAGENAAR等[25]研究表明，在Vps28缺失的条件下，肺腺癌细胞系A549对miR21抑制剂的摄取作用大大增强，侵袭能力明显减弱，增殖速度降低。上述研究结果提示，Vps28与miR21在肿瘤中的作用密切相关，Vps28的基因多态性在肿瘤发生发展过程中起到了重要的辅助作用。

本研究首次对Vps28基因rs2272658位点多态性与EBV相关肿瘤的易感性进行探讨。实验结果表明，EBVaNPC中TT基因型频率和T等位基因频率明显高于EBVnNPC组及NC组，提示T等位基因可能是EBVaNPC发病的危险因子，携带T等位基因可能会增加EBVaNPC的易感性。由此可以推断Vps28基因rs2272658位点多态性与EBVaNPC具有相关性。

本研究结果显示，EBVaL、EBVnL及NC组间Vps28基因rs2272658位点多态性分布无统计学差异，表明该位点的多态性与此类疾病无明显相关性。在EBV的生命周期中，口咽部和唾液腺等的上皮组织通常是病毒复制的主要部位[26-30]，而淋巴瘤为间叶组织中造血组织肿瘤，鉴于两者组织来源不同，EBV感染的潜伏类型也不尽相同，因此Vps28基因rs2272658位点多态性与EBV的相互影响更易于发生在上皮细胞的肿瘤中[31-32]。

总之，本研究结果提示Vps28基因rs2272658位点基因型频率、等位基因频率与EBVaNPC易感性有关，携带T等位基因会增加患EBVaNPC的风险，Vps28基因rs2272658位点多态性与淋巴瘤组织中EBV感染无相关性。Vps28基因rs2272658位点多态性与EBV感染及有关信号通路中的相互关系还有待更进一步的研究。