山羊口疮病毒的PCR诊断及防治

黄秀君

（四川省攀枝花市农林科学研究院，攀枝花 617000）

四川省攀枝花市某羊场饲养山羊520只，2018年初产羔450只，羔羊出生10 d左右呈爆发性发病，发病率100%。发病羊只主要为羔羊，在患羊嘴角、口唇、鼻孔周围及口腔黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成菜花状增生物，有的羊只体温升高、精神差、牙龈红肿，口流涎、采食困难或者不采食，患羊逐渐消瘦，衰竭而死亡［1］。由于该场发病数量多、治疗不及时，相继有62只患羊死亡。通过临床症状观察，初步确诊攀枝花某羊场羔羊疑似羊口疮病毒感染，然后运用半套式PCR方法对病料进行诊断，确诊病原并向该羊场提供可行的治疗方案。

1 材料

1.1 病料

采集攀枝花某爆发疑似ORFV羊场病羊口唇部的痂皮6份。

1.2 主要试剂

动物病毒DNA提取试剂盒，DNA Mark D2000，2×Power Taq PCR Master Mix、DNA纯化回收试剂盒、pGMT载体、质粒提取试剂盒，购自天根生物科技有限公司。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据邓宇［2］的文献设计引物，上游引物ORF-P1：CGCAAGCCCGAGATGGTAA；下游引物 ORF-P2：CGAGCCCCATGAAGGAAAA；上游引物 ORF-P3：GATGAGGACGAACGGCTGGTA，提交上海捷瑞生物工程有限公司合成；参考该文献的半套式PCR方法对待检口唇部痂皮样品进行检测。

2.2 口疮病毒DNA的提取

取ORFV XC13株细胞毒株疫苗毒株在-30℃反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min；取上清备用。用生理盐水清洗临床组织病料，用灭菌剪刀剪碎后，放入组织匀浆机中充分匀浆，收集匀浆液-30℃反复冻融2次，12 000 r/min离心5 min，取上清置-30℃冻存备用。取上清按动物病毒DNA提取试剂盒操作方法提取病毒DNA［2］。

2.3 羊口疮病毒的PCR鉴定

根据邓宇［2］的方法对6份DNA样品进行半套式PCR诊断。

2.4 PCR产物的纯化测序与鉴定

将上述鉴定正确的PCR产物用胶回收试剂盒进行回收纯化，回收产物送上海捷瑞生物工程有限公司测序，并对测序结果进行Blast比对。

3 结果与分析

采用半套式PCR对6份痂皮样品进行扩增，均获得大小为450 bp特异性扩增片段，与预期扩增DNA片段大小一致（图1）。回收、纯化、克隆、测序所获得的DNA片段，测序结果经GenBank中BLAST分析，与ORF毒株的同源性达98%以上，确诊病原为山羊口疮病毒。

图1 半套式PCR检测结果

4 治疗

4.1 单一外嘴唇型感染治疗

首先用生理盐水浸泡的棉球软化嘴唇结痂，然后用止血钳剥去痂皮，再用3%～5%的高锰酸钾溶液清洗创面后涂擦5%碘酊，最后用冰硼散撒布疮面，每天治疗2次，待病变处开始长出新的组织后停止治疗。

4.2 抗病毒，继发感染治疗

对体温升高，牙龈、舌面红肿，有溃疡或化脓的患羊，首先清除口腔内的坏死黏膜，然后用3%～5%的高锰酸钾溶液冲洗干净，再用冰硼散撒布疮面；同时使用注射用头孢噻呋钠3 mg/kg和复方板兰根注射液，0.2 mL/kg进行肌肉注射，每天1次，连用7 d。

5 预防

（1）不从疫区引进感染羊只。引进羊只隔离观察45 d无病方可合群饲养。在羊口疮常发流行地区，用羊口疮弱毒疫苗进行免疫接种，每年1次［3-4］。

（2）增强怀孕母羊及产仔母羊的营养，饲喂多汁及柔软的饲料，减少对口腔黏膜的损害，防止母羊口疮病毒发生感染羔羊。

（3）羔羊出生后，在新生羔羊的口、鼻处和哺乳母羊乳房用高锰酸钾溶液擦洗干净，防止母羊乳头和羔羊相互传染，每3天消毒1次，消毒后注意不要立即让羔羊吮乳［1］。

（4）保持圈舍及运动场清洁干燥。定期用2%氢氧化钠溶液或者10%石灰乳对羊舍、用具及周围环境消毒［4］。